Методика стереотаксически управляемой абляции для удаления слуховой коры у крыс

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Подготовка крысы

ПРИМЕЧАНИЕ: Мы провели эксперименты на самцах крыс, чтобы избежать каких-либо гормональных изменений.

1. Обезболивайте животное смесью кетамина гидрохлорида (30 мг/кг) и ксилазина гидрохлорида (5 мг/кг), вводимых внутримышечно; с этой дозой крысу следует глубоко обезболить в течение примерно 1 часа.
2. Ущипните крысу за палец; отсутствие рефлекса отхода указывает на то, что животное находится в полном бессознательном состоянии. Если крыса реагирует на щиплок, дайте дополнительную анестезию в размере одной трети от первоначальной дозы.
3. Побрейте кожу головы и продезинфицируйте операционную область повидон-йодом.
4. Поместите животное на грелку для поддержания температуры 38 °C и стабилизируйте голову животного в стереотаксической рамке с помощью двух ушных планок и прикусочной планки. Соблюдайте осторожность, чтобы не проколоть барабанную перепонку ушными раковинами.
5. Защитите глаза, нанеся каплю офтальмологического геля или сыворотки с солевым раствором на каждый глаз.

2. Расположение АК в височной кости крысы

1. С помощью скальпеля сделайте надрез по средней линии, чтобы обнажить череп и втянуть надкостницу, покрывающую поверхность черепа.
2. Используйте стерильный хлопчатобумажный наконечник, чтобы аккуратно удалить кровь, покрывающую поверхность черепа, чтобы визуализировать брегму, лямбду и межушное 0 в соответствии с атласом мозга крысы Paxinos and Watson.
3. Сделайте скальпелем надрез в височной мышце рядом с ее дорсальным внедрением на черепе. Вытяните мышцу с помощью иглы и шовного материала и зафиксируйте шовный материал на стереотаксической раме; Это обнажит височную кость. При возникновении кровотечения следует промыть холодным стерильным физиологическим раствором.
4. Поместите стерильную прямую иглу в стереотаксический микроманипулятор, убедившись в ее полной фиксации.
5. Медленно опустите иглу до тех пор, пока она не окажется прямо над поверхностью черепа, так, чтобы кончик иглы был установлен на межушное 0. Установите эту точку равной нулю и определите координаты от этой точки.
6. В зависимости от интересующей вас области мозга варьируйте стереотаксические координаты. Определите эти координаты, используя атлас мозга крысы Паксиноса и Уотсона. После того, как координаты определены, переместите стрелку в соответствии с этими координатами.
7. Нацеливайтесь на АС, используя координаты следующих четырех точек: A: переднезадняя (A/P) = -5,8 мм, медиолатеральная (M/L) = +/- 6,4 мм; B: A/P= -2,7 мм, M/L= +/- 6,4 мм; C: A/P= -2,7 мм, M/L= +/- 8,67 мм; D: A/P= -5,8 мм, M/L= +/- 8,67 мм. Опустите иглу прямо над височной костью, чтобы визуализировать каждую из этих четырех точек. С помощью маркера отметьте точки на височной кости и соедините их для того, чтобы нарисовать прямоугольник; прямоугольник будет служить ориентиром для открытия окна в кости (рисунок 1).

3. Хирургическое воздействие на переменный ток

1. Откройте окно с помощью электрической дрели и небольшого сверла (Ø 0,6 мм). Просверлите периметр прямоугольника со скоростью 8 000 оборотов в минуту, пока кость не сдастся. Охладите поверхность сверления путем промывки холодным стерильным физиологическим раствором, чтобы предотвратить повреждение подкорковых структур. Когда кость поддается, может быть обнаружено падение сопротивления. Будьте осторожны, чтобы не просверлить мозг.
2. Когда границы ослабнут, подтяните покрывающую кость тонкими щипцами и храните ее в холодном стерильном физрастворе.

4. Абляция переменного тока

1. С помощью хирургического микроскопа (10X) аккуратно разрежьте мозговые оболочки микрохирургическим ножом и удалите их с помощью двух тонкозаостренных щипцов. При возникновении кровотечения следует промыть холодным стерильным физиологическим раствором.
2. Аккуратно аспирируйте АК с помощью хирургического аспиратора (давление -0,24 бар), соединенного со стерильной иглой с тупым концом 20 G. Этот пункт имеет решающее значение и должен быть выполнен очень осторожно: аспирируйте только шесть слоев коры головного мозга, а не нижележащее белое вещество.
3. Аспирируйте до тех пор, пока перфорантные артерии не перестанут кровоточить.
4. Когда аспирация будет завершена, накройте травмированный участок извлеченной костью и наложите рассасывающуюся кровоостанавливающую марлю.
5. Дайте височной мышце восстановить исходное положение, а затем зашите кожу с помощью раневых зажимов (9 мм). Применяют мазь с антибиотиком. Продолжайте наносить мазь на рану два раза в день в течение трех дней.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Каждое применение состоит из тонкого слоя, наносимого на рану.
6. Бупренорфин вводят подкожно в спину крысы (0,05 мг/кг) в качестве анальгетика через 1 ч после операции, а затем каждые 8 ч в течение 72 ч.
7. Держите животное на грелке, пока оно не проснется, и верните его в клетку для выздоровления.

Рисунок 1: Изображения височной кости крысы на трех различных хирургических этапах. (A) Перенос стереотаксических координат переменного тока в височную кость. Координаты четырех точек: A: A/P= -5,8 мм, M/L= +/- 6,4 мм; B: A/P= -2,7 мм, M/L= +/- 6,4 мм; C: A/P= -2,7 мм, M/L= +/- 8,67 мм; D: A/P= -5,8 мм, M/L= +/- 8,67 мм. (B) Координаты используются в качестве ориентира для рисования прямоугольника на поверхности височной кости, который будет направлять открытие окна. (C) Показывает окно, открывшееся в кости после сверления. Мозговые оболочки с кровеносными сосудами могут наблюдаться на поверхности мозга. R: ростральный, D: спинной.