День 1
1. Мечение митохондрий мезенхимальных стволовых клеток (МСК)
- За два дня до подготовки митохондрий засейте человеческие МСК в 100 мм чашке cultAure в 10 мл (Minimum Essential Medium Eagle)/FBS (фетальная бычья сыворотка) 10%, чтобы иметь 4 x 105 МСК в культуре в 1-й день.
- Промойте МСК PBS (4 мл) и добавьте 4 мл αMEM/FBS 1% (предварительно подогретый до 37 °C).
- Добавьте необходимое количество митохондриального жизненно важного красителя и инкубируйте клетки в течение 30 мин в инкубаторе при температуре 37 °C.
- Удалите раствор красителя из митохондрий, дважды промойте клетки 4 мл предварительно подогретого (37 °C) αMEM/FBS 1% и добавьте обратно 4 мл αMEM/FBS 10%. Инкубируйте клетки при 37 °C.
- Смените питательную среду (10 мл αMEM/FBS 10%) через 30 минут и еще раз через 2 часа.
День 1
2. Мечение стволовых клеток глиобластомы (GSC)
- Диссоциация GSCs Gb4 клеточной линии (10 x 106 клеток), выращенных в виде нейросфер на колбах для клеточных культур, покрытых поли-HEMA
- Затравите GSC в 48-луночный планшет со скоростью 105 клеток/лунку в пролиферирующей среде GSC (500 μл) (см. таблицу 1).
- Центрифугируйте планшет при давлении 270 x g в течение 5 минут при 20 °C.
- Добавьте необходимое количество клеточного жизненно важного красителя и инкубируйте в течение 30 минут при температуре 37 °C.
- Добавьте 500 μл базальной среды GSC (Таблица 1) на лунку 48-луночного планшета.
- Центрифугируйте планшет при температуре 270 x g при 20 °C в течение 5 мин. Аспирируйте надосадочную жидкость.
- Повторите шаги с 2.5 по 2.6.
- Добавьте 500 μл базальной среды GSC и инкубируйте при 37 °C в течение 30 минут.
- Центрифугируйте планшет при температуре 270 x g при 20 °C в течение 5 мин. Аспирируйте надосадочную жидкость.
- Добавьте 500 μл пролиферационной среды GSC на лунку 48-луночного планшета и инкубируйте в инкубаторе с температурой 37 °C.
заметка: Указанное количество GSC (10 x 106 клеток) позволяет проводить различные эксперименты «доза-реакция» и контроль FACS. Как только условия эксперимента будут определены более точно, это количество можно уменьшить.
3. Посев стволовых клеток глиобластомы
- Соберите нейросферы GSC (стволовые клетки глиобластомы) (10 x 106 клеток) путем центрифугирования при 270 x g в течение 5 мин, при 20 °C в пробирке объемом 50 мл.
- Промойте ячейки 5 мл HBSS (сбалансированного солевого раствора Хэнкса) и центрифугируйте при 270 x g в течение 5 минут при 20 °C.
- Аспирируйте надосадочную жидкость.
- Аккуратно суспендируйте гранулу GSC в 100 мкл трипсина-ЭДТА (этилендиамина тетрауксусной кислоты) (0,25%) (на 10 x 106 клеток)
- Выдерживать при 37 °C в течение 3 минут.
- Добавьте 10 мкл CaCl2 (20 мМ) и 2 мкл ДНКазы I (10 мг/мл).
- Диссоциируйте нейросферы, аккуратно пипетируя вверх и вниз (30-50x) с помощью пипетки P200. Избегайте образования пузырей. Проверьте под микроскопом, что все ГСК диссоциированы.
- Добавьте 10 мкл ингибитора трипсина (5%) и 10 мл HBSS.
- Центрифугируйте GSC при давлении 270 x g в течение 7 мин при 20 °C.
- Выбросьте надосадочную жидкость и добавьте 10 мл базальной среды GSC .
- Подсчитайте GSC с помощью счетной камеры Thoma, а затем центрифугируйте элементы при 270 x g в течение 7 мин при 20 °C.
- Добавьте соответствующий объем пролиферирующей среды GSC для достижения клеточной концентрации10-6 GSCs/мл.
- Затравите10 5 GSC (100 мкл клеточной суспензии) в лунку 96-луночного планшета.
- Центрифугируйте планшеты при давлении 270 x g в течение 7 минут при 20 °C, чтобы получить GSC на дне лунок.
- Инкубируйте 96-луночный планшет при 37 °C.
День 2
4. Выделение митохондрий из MSC (мезенхимальных стволовых клеток)
- Отрегулируйте температуру центрифуги в микропробирке до 4 °C.
- Подготовьте две пробирки «А» и «С» объемом 1,5 мл, содержащие реагенты для экстракции митохондрий (200 мкл реагента А и 400 мкл реагента С, содержащие ингибиторы протеазы, не содержащие ЭДТА). Подготовьте еще 2 пробирки, помеченные "MSC" и "Mito". Держите все трубки на льду. Также подготавливают трубки для серийных разведений в митохондриях.
- Промойте МСК 10 мл предварительно подогретым (37 °C) PBS (фосфатно-солевой буфер).
- Промойте МСК 2 мл трипсина (без ЭДТА) в течение 10 секунд и добавьте 1 мл трипсина (без ЭДТА). Инкубировать клетки в течение 5-10 мин при 37 °C.
- Восстановите МСК, добавив 10 мл αMEM /FBS 10%, переложите в пробирку объемом 50 мл.
- Центрифугируйте ячейки при давлении 270 x g в течение 5 мин при 20 °C.
- Выбросьте надосадочную жидкость и добавьте 10 мл αMEM/FBS 10% в клеточную гранулу.
- Подсчитайте МСК с помощью счетной камеры Малассеза.
- Центрифугируйте МСК (4-5 x 105) при 270 x g в течение 5 мин при 20 °C.
- Выбросьте надосадочную жидкость, добавьте 1 м ледяного αMEM/FBS 10% в клеточную гранулу и перенесите клетки в пробирку, меченную «MSC». Держите трубку на льду.
- Центрифугируйте пробирку, содержащую МСК, при давлении 900 x g в течение 5 минут при 4 °C.
- Удалите все остатки среды из трубки.
- Добавьте 200 мкл реагента для выделения митохондрий А (содержащего ингибиторы протеазы, не содержащие ЭДТА). Вихрь на средней скорости в течение 5 секунд и оставить трубки на льду ровно на 2 минуты.
- Добавьте 2,5 мкл реагента для выделения митохондрий B. Vortex на максимальной скорости в течение 10 сек, а затем оставьте пробирки на льду. Повторяйте каждые 30 секунд в течение 5 минут.
- Добавьте 200 мкл реагента для выделения митохондрий C (содержащего ингибиторы протеазы, не содержащие ЭДТА). Перемешивайте, наклоняя трубку (примерно 30 раз, не завихривайте). Центрифугируйте пробирку при давлении 700 x g в течение 10 минут при 4 °C.
- Перенесите надосадочную жидкость (содержащую митохондрии МСК) в трубку «Мито».
- Центрифугируйте при 3 000 x g, 15 мин при 4 °C, чтобы получить митохондриальную гранулу. Выбросьте надосадочную жидкость. Гранула содержит изолированные митохондрии.
- Промойте митохондриальную гранулу 200 μл реагента С. Затем центрифугируйте при 12 000 x g, 5 минут при 4 °C, чтобы получить митохондриальную гранулу.
5. Перенос изолированных митохондрий МСК в ГСК (MitoCeption)
- Добавьте 200 мкл предварительно охлажденной (0 °C) пролиферирующей среды GSC в митохондриальную гранулу, выделенную из МСК (4 x 105).
- Разбавляют митохондриальный препарат (в пролиферирующей среде GSC) для последовательного добавления 20 мкл митохондриальной суспензии к GSC.
- Добавьте объем изолированных митохондрий в лунки 96-луночного планшета, содержащего ГСК, в желаемой концентрации (от 0,1 до 10 мкг). Добавляйте митохондрии медленно, близко к дну лунки, покрывая всю поверхность по крайней мере один раз.
- Центрифугируйте 96-луночный планшет, содержащий митохондрии-реципиент ГСК, с митохондриями МСК и контрольной пластиной при 1500 x g в течение 15 мин при 4 °C.
- Сразу после центрифугирования поместите культуральные планшеты в клеточный инкубатор при температуре 37 °C.
заметка: Протокол переноса митохондрий основан на центрифугировании митохондриальной суспензии на культивируемых клетках при достаточной силе центрифугирования, с рядом центрифугирований, которые могут быть скорректированы в зависимости от системы митохондриальных доноров/реципиентных клеток.
Таблица 1: Культурные среды.
| Среда для культивирования клеток | состав |
| GSC базальная среда | DMEM/F-12 с дополнением |
| Инсулин 20 мг/мл |
| Доплата N2 1x |
| Глюкоза 3 г/л |
| L-глютамин 2 мМ |
| Среда распространения GSC | Добавить в прикорневую среду: |
| Добавка B27 1x |
| ЭФР 10 нг/мл |
| bFGF 10 нг/мл |
| Фунгин 10 мг/мл |
| Фунгизон 0,25 мг/мл |
| Гепарин 2 мг/мл |
| Ципрофлоксацин 2 мкг/мл |
| Гентамицин 2 мкг/мл |
| Среда распространения MSC | αMEM с дополнением |
| L-глютамин 2 мМ |
| 10% FBS |
| bFGF 2 нг/мл |
