Флуоресцентное окрашивание клеток нервного гребня, культивируемых на гидрогелях различной жесткости

Аннотация

Источник: Le, T. P., et al., Оптимизированная O9-1/гидрогелевая система для изучения механических сигналов в клетках нервного гребня. J. Vis. Exp. (2021)

В этом видео мы описываем процедуру проведения флуоресцентного окрашивания с помощью флуоресцентной микроскопии для демонстрации окрашивания фаллоидином клеток нервного гребня, культивируемых на гидрогелях различной жесткости, для визуализации и анализа организации цитоскелета.

Протокол

1. Молекулярный анализ жесткости с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания

1. Используйте пинцет для транспортировки покровного стекла на новую пластину, чтобы свести к минимуму ложные сигналы от клеток, выращенных непосредственно на пластине. Промойте клетки 500 мкл стерильного PBS три раза, чтобы удалить мертвые клетки и остатки питательной среды.
2. Зафиксируйте клетки с помощью 500 мкл 4% параформальдегида (PFA) в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем повторно промойте ячейки три раза, используя 500 μL PBS/лунку в течение 2 минут каждая.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хранить при температуре 4 °C для процедурной остановки.
3. Обработайте клетки 500 мкл 0,1% Triton X-100 в течение 15 минут при комнатной температуре. Затем трижды промойте клетки 500 μL PBS/лунка.
4. Заблокируйте клетки 250 мкл 10% сыворотки осла (разбавленной в PBS и 0,1% Tween 20) в лунку на 30 минут при комнатной температуре.
5. Инкубируйте клетки с фаллоидином, используемым для окрашивания F-актином в разведении 1:400 в 250 мкл 10% сыворотки осла, в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем трижды промойте клетки PBS по 5 минут каждая.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Фаллоидин с длиной волны 568 нм может быть совместно инкубирован с вторичными антителами с длиной волны 488 нм или 647 нм или самостоятельно.
6. Инкубируйте клетки с 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI, разведение 1:1000) в 250 мкл PBS в течение 10 мин, а затем в последний раз промывайте PBS в течение 2 мин.
7. В каждую лунку добавьте по 3-4 капли монтажного средства. Храните образцы при температуре 4 °C для схватывания не менее 2 часов перед получением изображения, чтобы убедиться, что монтажная среда настроена правильно.
8. С помощью флуоресцентного микроскопа можно получить изображения не менее 3 случайных кадров для каждого образца гидрогеля, создавая отдельные и объединенные каналы.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
2 мм #1 Corning 0211 Стеклянное покровное стекло	Химгласс Медико-биологические науки	CLS-1763-012
25 мм #1 Corning 0211 Стеклянное покровное стекло	Химгласс Медико-биологические науки	CLS-1763-025
4-луночный планшет для культивирования клеток	Термонаучный	179830
4% Параформальдегид	Сигма Олдрич	J61899-AP
40% Акриламид	Сигма Олдрич	А4058
Alexa Fluor 488 Фаллоидин	Термо Фишер	А12379
Коллаген I типа (100 мг)	Корнинг	354236
DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол, дигидрохлорид)	Термо Фишер	D1306
Ослиная сыворотка	Сигма Олдрич	D9663
Стерильный 1x PBS	Гиклон	SH30256.02
Флуоресцентный микроскоп	Leica