$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.
1. Приготовление рабочих растворов и буферов
ПРИМЕЧАНИЕ: Утром в день проведения анализа приготовьте следующие растворы. Этот расчет основан на необходимых решениях для обработки двух областей мозга (т.е. префронтальной коры [PFC] и гиппокампа [HPC]) у 12 мышей.
- Приготовьте искусственную спинномозговую жидкость (aCSF, pH = 7,4), как указано в таблице Таблица 1. Налейте 750 μL aCSF в каждую пробирку для отбора проб и поместите их в металлический температурный блок на льду для предварительного охлаждения буфера.
- Подготовьте буфер для лизиса, как указано в таблице Таблица 2. Хранить на льду (400 μл на образец).
- Приготовьте 52 мМ Бис(сульфосукцинимидил)суберата или стоковый раствор BS3 (26x) в 5 мМ буфере цитрата натрия (pH = 5,0).
- Сначала приготовьте 100 мМ лимонной кислоты (запас А) и 100 мМ цитрата натрия (запас В).
- Разбавьте бульон А и бульон Б в соотношении 1:20 с деионизированной водой. Добавьте по 100 мкл к 1,9 мл воды для приготовления 5 мМ лимонной кислоты (запас С) и 5 мМ цитрата натрия (запас D) соответственно.
- Смешайте 410 мкл запаса C и 590 μл запаса D для получения буфера цитрата натрия массой 5 мМ (pH = 5,0) (раствор E, 1 мл).
- Подтвердите pH раствора Е с помощью индикаторной полоски.
- Растворите 24 мг BS3 в 806,4 мкл раствора Е путем вортексирования в течение 30 с для приготовления исходного раствора BS3 (26x).
- Приготовьте еще 1 мл раствора Е для использования в качестве транспортного средства для несшивающихся образцов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте исходный раствор BS3, когда все остальное будет готово, и эксперимент вот-вот начнется. BS3 следует хранить в высушенном виде при температуре 4 °C до использования. После восстановления BS3 остается активным только в течение примерно ≤3 ч. Поскольку сообщается, что pH буфера цитрата натрия 5 мМ (раствор Е) со временем повышается, вызывая ускоренный гидролиз BS3, рекомендуется готовить раствор Е в свежем виде из исходных растворов А и В. Из-за ограниченной растворимости BS3 при низких температурах восстановленный BS3 следует хранить при RT. Используйте восстановленный BS3 в течение 3 ч, и не замораживайте/размораживая и не используйте повторно восстановленный BS3.
2. Вскрытие тканей мозга
ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этого шага, по крайней мере два человека должны работать вместе скоординированным образом. В то время как один человек сосредотачивается на вскрытии животного, другой человек должен работать в качестве хронометриста и помогать координировать анализ.
- Первое животное для вскрытия приведите из зоны содержания в помещение для вскрытия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку острые стрессоры (например, новая среда, запах крови) могут влиять на динамику белков мозга, животных следует содержать в их домашних клетках, расположенных вдали от зоны вскрытия, а затем их следует доставлять по отдельности в комнату для вскрытия для немедленного обезглавливания.
- Усыпите мышь путем вывиха шейки матки с последующим обезглавливанием. Быстро извлеките мозг из черепа и погрузите его в ледяную PBS в чашку Петри на 10-15 секунд (Рисунок 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Животных не анестезируют в экспериментах с BS3, так как любой анестетик потенциально может повлиять на уровень поверхностного представления рецепторов нейротрансмиттеров.
- Поместите охлажденный мозг в матрикс мозга на льду вентральной стороной мозга вверх (Рисунок 2).
- Вставьте первое лезвие бритвы через границу между обонятельной луковицей и обонятельным стеблем, чтобы разрезать мозг коронально (Рисунок 3). С помощью трех-четырех дополнительных бритвенных лезвий последовательно надрежьте переднюю часть головного мозга венально с интервалом в 1 мм.
- Снимите корональные срезы с матрицы мозга, удерживая все вставленные бритвенные лезвия вместе, оставляя заднюю часть мозга позади матрицы мозга. С помощью щипцов отделите лезвия бритвы друг от друга и положите их на плоскую охлажденную поверхность срезом мозга вверх (Рисунок 4).
- Определите срезы, содержащие интересующую область. Для отбора проб ПФК выберите второй и третий срезы позади первого среза, содержащего обонятельный стебель.
- Удалите интересующую область с помощью прокола для ткани, отложите ее в сторону на охлажденное лезвие бритвы и равномерно разделите ткань на две части (например, ткани из левого и правого полушарий, причем одна половина будет использоваться для реакции сшивки BS3, а другая половина — для контроля без сшивки, если целевой белок, представляющий интерес, одинаково экспрессируется в обоих полушариях).
- Измельчите каждую салфетку на кусочки на лезвии бритвы с помощью тонкого кончика щипцов с многократными вертикальными движениями против лезвия вместо того, чтобы разминать или измельчать салфетки. Это позволит максимально увеличить площадь поверхности, доступную для BS3, без серьезного нарушения целостности мембраны клеток. Сразу после измельчения переложите измельченные салфетки в соответствующие пробирки (см. пункт 3.3).
3. Реакция сшивки
- Приведите следующее животное для вскрытия из зоны содержания в помещение для вскрытия, когда вскрытие мозга предыдущей мыши подходит к концу (шаг 2.10).
- Наполните предварительно охлажденную на льду пробирку 30 мкл раствора BS3 (26x) или раствора носителя E непосредственно перед тем, как измельченные салфетки будут готовы к переносу в соответствующие пробирки. Замените наконечники пипеток между пробирками, чтобы убедиться в отсутствии загрязнения BS3 в контрольных трубках, не вызывающих сшивку.
- Переложите измельченные салфетки (из шага 2.8) в соответствующие пробирки, а затем приступайте к препарированию следующего животного (шаг 2.2).
- Переверните и перемешайте пробирку, чтобы разбить куски ткани на более мелкие кусочки, и начните инкубацию образцов на ротаторе пробирки в холодильной камере от 30 минут до 2 часов. Запишите время начала инкубации BS3 для каждой пробирки. Смотрите раздел обсуждения для оптимального времени инкубации.
- Погасите реакцию, добавив в пробирку 78 мкл 1 М глицина, и далее инкубируйте образец в течение 10 мин при 4 °C при постоянном вращении. Запишите время начала и окончания тушения для каждой трубы. Продолжайте помогать человеку, сосредоточившись на вскрытии животного, приводя следующее животное (шаг 3.1) и помогая с сшиванием (шаг 3.2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Обрабатывайте каждый образец в одно и то же время для всех образцов. Если помещение для вскрытия находится далеко от холодильного помещения, настоятельно рекомендуется нанять третьего человека для участия в инкубации и закалке образцов в холодильной камере.
Таблица 1: Состав искусственной спинномозговой жидкости.
| Рабочая конс. | Стоковый раствор | Количество исходного раствора для выдачи |
| 1,2 мМ CaCl2 | 480 мМ (400x)* | 100 μL |
| 20 мМ HEPES | 1 м (50x) | 800 μL |
| 147 мМ NaCl | 5 м (34 раза) | 1176.5 μL |
| 2,7 мМ KCl | 1,08 м (400x) | 100 μL |
| 1 мМ MgCl2 | 400 мМ (400x) | 100 μL |
| 10 мМ глюкозы | 2,5 м (250x) | 160 μL |
| Деионизированная вода | | 37,563 мл |
| Итого | | 40 мл |
| * Бульон CaCl2 должен быть свежеприготовленным в день эксперимента. |
Таблица 2: Состав буфера для лизиса
| Рабочая конс. | Стоковое решение | Количество исходного раствора для выдачи |
| 25 мМ HEPES | 1 м (40x) | 500 μL |
| 500 мМ NaCl | 5 м (10x) | 2 мл |
| 2 мМ ЭДТА | 0,5 м (250x) | 80 μL |
| 1 мМ DTT | 1 м (1000x) | 20 μL |
| 0,1% NP-40 | 10% (100x) | 200 μL |
| Коктейль ингибиторов протеазы | 100x | 200 μL |
| Деионизированная вода | | 17 мл |
| Итого | | 20 мл |
