Оценка поглощения глюкозы в моторных нейронах личинок дрозофил с повышенным метаболизмом глюкозы

Аннотация

Источник: Логанатан, С., и др., Измерение поглощения глюкозы в моделях протеинопатии TDP-43 у дрозофил. J. Vis. Exp. (2021).

Видео демонстрирует технику измерения поглощения глюкозы в моторных нейронах личинок дрозофилы с использованием внутриклеточного датчика глюкозы на основе флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET). После препарирования личинок для обнажения вентрального нервного канатика, моторные нейроны визуализируются с помощью флуоресценции, излучаемой донором датчика флуорофором. При стимуляции глюкозой FRET между донором сенсора и акцепторными флуорофорами вызывает излучение флуоресценции от акцептора, что позволяет сравнивать поглощение глюкозы между контрольными личинками и мутантными личинками с повышенным метаболизмом глюкозы.

Протокол

1. Drosophila Вскрытие вентрального нервного канатика (VNC)

1. Сделайте посуду для вскрытия силиконового эластомера.
   1. Налейте компоненты силиконового эластомера в пробирку объемом 50 мл, как указано в протоколе производителя, и хорошо перемешайте.
   2. Заполните 35-миллиметровые чашки для культуры тканей примерно 2 мл смеси эластомеров. Используйте шприц, чтобы удалить любые пузырьки. Накройте посуду крышкой и поставьте ее на ровную поверхность в духовку при температуре 60 °C на ночь, чтобы она застыла.
2. Препарируйте личинки Drosophila, чтобы обнажить VNC, сохраняя жизнеспособность тканей.
   1. Соберите блуждающую личинку третьего возраста, промойте ddH₂O, а затем поместите ее в каплю гемолимфоподобного 3 (HL3) буфера (70 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 20 мМ MgCl₂, 10 мМ NaHCO₃, 115 мМ сахарозы, 5 мМ трегалозы, 5 мМ гидроксиэтилпиперазина этановой сульфоновой кислоты [HEPES]; pH 7,1) на чашку, выстланную эластомером.
   2. С помощью пары щипцов (щипцов #5 или 55) под препарирующим микроскопом приколите передний и задний концы личинки тыльной стороной вверх, осторожно растягивая личинку вдоль булавками от насекомых (Minutein Pins).
   3. Сделайте надрез чуть выше заднего штифта с помощью наклонных ножниц для радужной оболочки. Сделайте вертикальный надрез, начиная от разреза по направлению к переднему концу личинки.
   4. При необходимости добавьте несколько капель буфера HL-3. Удалите трахею и остальные плавающие органы, не нарушая центральную нервную систему (ЦНС). Прикрепите лоскуты, растягивающие стенку тела, чтобы обнажить ЦНС, сохраняя при этом нервно-мышечную систему (VNC, аксоны и нервно-мышечные соединения) нетронутой.

2. Получение изображения

1. Оптимизируйте параметры визуализации.
   1. Включите микроскоп и лазеры перед началом вскрытия. Изображения должны быть получены с помощью вертикального конфокального микроскопа с 40-кратным погружным объективом. Используйте лазер с длиной волны 405 нм для возбуждения голубого флуоресцентного белка (CFP) и получения изображений как в каналах детектирования CFP (465-499 нм), так и в каналах детектирования FRET (535-695 нм).
   2. Оптимизируйте параметры сбора данных, такие как скорость сканирования (6), среднее значение (2), объектив (40x), зум (1x), размер точечного отверстия (1 AU) и пространственное разрешение (512 x 512). Отрегулируйте усиление таким образом, чтобы сигнал находился в оптимальном динамическом диапазоне. Для всех генотипов необходимо использовать одни и те же параметры.
2. Визуализируйте моторные нейроны в VNC.
   1. Поместите силиконовую тарелку с рассеченным образцом под линзу. Опустите линзу так, чтобы она соприкасалась с трегалозно-сахарозным буфером HL3. Критически важно следить за тем, чтобы объектив был полностью погружен в буфер. При необходимости добавьте больше буфера.
   2. Используйте каналы CFP и FRET для ручного выбора оптического участка, состоящего как минимум из 6 моторных нейронов в фокусе, расположенных вдоль средней линии VNC. Моторные нейроны идентифицируются на основе экспрессии датчика глюкозы и положения вдоль передне-задней оси.
   3. Получение изображений каждые 10 с в течение 10 минут. Эти изображения представляют собой базовую линию.
3. Стимулируйте с помощью глюкозы, дополненной HL-3.
   1. Удалите трегалозно-сахарозный HL3-буфер с помощью пастеровской пипетки и замените его 5 мМ глюкозой с добавлением HL-3 (70 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 20 мМ MgCl₂, 10 мМ NaHCO₃, 115 мМ сахарозы, 5 мМ глюкозы, 5 мМ HEPES, pH 7,1). Этот шаг нужно выполнять с большой осторожностью, чтобы максимально избежать движения VNC.
   2. Получайте изображения каждые 10 секунд в течение следующих 10 минут. Эти изображения представляют фазу стимуляции.
4. Сохраните изображения в виде файлов .czi или любого другого типа, поддерживаемого программным обеспечением для обработки изображений, с именем файла, включающим дату, генетический фон, экспериментальное состояние (исходное состояние или стимуляция) и используемые каналы.
5. Повторно используйте параметры для визуализации всех генотипов (рис. 1A).

Результаты

Рисунок 1: Анализ изображений датчика глюкозы в контексте мутанта TDP-43. (A) Репрезентативные изображения сигналов FRET и CFP в контрольных элементах датчиков глюкозы и образцах TDP-43^G298S в исходных и стимулирующих условиях. Репрезентативный моторный нейрон обведен на каждом изображении в качестве примера ROI. Масштабные линейки: 20 мкм. Увеличение: 40x. (B

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
35 мм чашки для культуры тканей	Сигма Олдрич	CLS430165
40X водная иммерсионная линза	Zeiss	440090	dipable, N.A. 0.8
Ножницы для вскрытия	Робоз	РС-5618
Щипцы Dumont #5	VWR	100189-236
Щипцы Dumont #55	VWR	100189-244
Minutien pins	Инструменты изобразительной науки	26002-10	используется для вскрытия
SYLGARD 184 Набор силиконовых эластомеров	Доу	1317318
Zeiss LSM880 NLO вертикальный многофотонный/конфокальный микроскоп	Zeiss	Н/Д