$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.
1. Иммуноокрашивание
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все промывки и инкубации на вибростенде орбитальной платформы, настроенном примерно на 100 оборотов в минуту. Все этапы выполняются при комнатной температуре, за исключением первичной инкубации антител, которая проводится при 4 °C. Заранее подготовьте монтажную среду, соединив ингредиенты в пробирке объемом 50 мл и перемешав на нутаторе в течение ночи. Беречь от света и хранить при температуре 4 °C до 2 месяцев. Если эндогенный флуоресцентный сигнал достаточен для визуализации и анализа без необходимости иммуноокрашивания, шаги 1.1-1.9 можно пропустить. Если вы пропускаете иммуноокрашивание, выполните три полоскания по 10 минут в TBS и перейдите к шагу 1.10.
- Приготовьте свежий раствор TBST (0,2% Triton in TBS), добавив 1 мл 10% Triton-X в 50 мл пробирки и заполнив пробирку до 50 мл 1x TBS. Приготовьте по 2 мл растворов блокирующих и антител (10% козья сыворотка в TBST) для каждого мозга.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наилучших результатов делайте новый TBST для каждого нового эксперимента по окрашиванию и используйте высококачественный источник 10% водного Triton-X (Таблица материалов).
- Маркировка 24-луночного планшета в соответствии со схемой (Рисунок 1). Размещайте разные образцы в разных рядах и разные растворы в разных столбцах. Добавьте 1 мл TBST в первые три столбца («Wash 1», «Wash 2» и «Wash 3»). Добавьте 1 мл блокирующего раствора в четвертую колонку.
- Приготовьте стеклянную кирку, расплавив конец пипетки Пастера 5,75 в маленький крючок с помощью горелки Бунзена. Используйте этот медиатор для переноса срезов ткани из 12-луночного планшета в столбец «Промывка 1» 24-луночного планшета.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наилучших результатов, просейте участки перед началом окрашивания. Чтобы просеять срезы, перенесите срезы один за другим в чашку Петри, заполненную 1x TBS, и исследуйте срезы с помощью флуоресцентного микроскопа с объективом 5x или 10x, чтобы убедиться в наличии достаточного количества флуоресцентно меченых клеток. Рекомендуется окрашивать от четырех до шести секций на лунку, хотя при необходимости можно окрашивать до восьми секций на лунку.
- Промойте секции в течение 10 мин каждая в лунках 1, 2 и 3, после чего инкубируйте их в течение 1 ч в блокирующем растворе. С помощью медиатора для стекла перекладывайте секции из одной лунки в другую. Медиатор можно использовать для одновременного переноса нескольких участков мозга.
- Приготовьте 1 мл раствора первичного антитела для каждого образца (например, Rabbit RFP 1:2000 или Chicken GFP 1:2000). Добавьте антитело в раствор антитела, кратковременно перемешайте, а затем центрифугируйте в течение 5 минут при ≥ 4000 x g при 4 °C. Инкубируйте участки первичного антитела в течение двух-трех ночей при 4 °C при встряхивании.
- После первичной инкубации антител аспирируйте Day 1TBST из промывочных лунок, добавьте 1 мл нового TBST в каждую промывочную лунку и переместите срезы в первую промывочную лунку. Промойте секции 3 раза по 10 минут каждая.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для аспирации используйте 9-дюймовую пастерскую пипетку, соединенную трубкой с вакуумной колбой. В качестве источника вакуума можно использовать домашние вакуумные линии или электрический вакуумный насос.
- Во время промывки срезов готовят вторичные растворы антител в концентрации 1:200 путем добавления антител к раствору антитела (например, козий антикроличьи 594 или козий антикуриный препарат 488). Кратковременно сделайте вихрь, а затем вращайте в течение 5 минут при ≥ 4,000 x g при 4 °C.
- Инкубируйте срезы во вторичном антителе в течение 3 ч при комнатной температуре. Защищайте срезы от света во время этого и всех последующих шагов, чтобы смягчить обесцвечивание вторичных антител.
- После вторичной инкубации антител аспирируйте Day 2 TBST из промывочных лунок, добавьте 1 мл нового TBST в каждую промывочную лунку и переместите срезы в первую промывочную лунку. Промойте секции 3 раза в TBST в течение 10 минут каждая.
- Во время окончательной промывки извлеките монтажный материал из температуры от 4 °C и дайте ему нагреться до комнатной температуры. Приготовьте смесь 2:1 из 1x столовая ложка воды: дистиллированная вода и добавьте ее в чашку Петри. Приготовьте предметное стекло микроскопа, добавив на поверхность 800 мкл 2:1 TBS:dH2O.
ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется использовать неотверждаемые монтажные носители. Упрочняющая монтажная среда может изменить объем ткани, что может затруднить анализ объема территории астроцитов. Рецепт простого и недорогого самодельного монтажного носителя представлен в таблице материалов Таблица.
- С помощью тонкой кисти переложите секции по одному из лунки Wash 3 в чашку Петри. На этом этапе тритон удаляется и срезы выравниваются. Далее переложите срезы из чашки Петри в жидкость на предметном стекле.
- Используйте кисть, чтобы расположить секции так, чтобы они были плоскими на предметном стекле. Осторожно удалите лишнюю жидкость с предметного стекла с помощью пипетки P1000 с последующей вакуумной аспирацией.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте наконечник пипетки P200 на конец пипетки Пастера для более точного контроля вакуумной аспирации.
- После того, как вся лишняя жидкость будет удалена с предметного стекла, с помощью передаточной пипетки немедленно добавьте по одной капле монтажного материала в каждую секцию и аккуратно наложите покровный стекло на предметное стекло. Дайте монтажному материалу распределиться в течение нескольких минут, а затем удалите излишки монтажного материала, выходящие из-под защитного стекла, с помощью вакуумной аспирации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не дайте секциям высохнуть перед добавлением монтажного материала. Если срезы начинают сохнуть до того, как будет добавлен монтажный материал, это может повлиять на объем ткани и затруднить точный сбор данных.
- Заклейте все четыре края покровного стекла прозрачным лаком для ногтей. Дайте предметным стеклам высохнуть в течение 30 минут при комнатной температуре, а затем храните их в горизонтальном виде при температуре 4 °C. Подождите не менее 2 часов перед получением изображения или снимок на следующий день.
ПРИМЕЧАНИЕ: Срезы, окрашенные антителами против GFP (зеленый флуоресцентный белок) и RFP (красный флуоресцентный белок), могут храниться до 2 недель перед визуализацией, при условии, что они полностью запечатаны лаком для ногтей.
