$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры по сбору проб были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Разрезание ткани
- Отрежьте небольшой кусочек ткани (~1 см х 1 см) для разреза. Верните оставшуюся салфетку в морозильную камеру с температурой -80 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что участок ткани на ~95% состоит из коры мозжечка, где расположены клетки Пуркинье.
- Поместите холмик ОКТ высотой примерно 3 мм, чтобы покрыть «патрон». Начните с создания слоев сверху медленными круговыми движениями, пока не получится небольшой холмик.
- Как только ОКТ частично замерзнет, но в центре все еще будет немного жидкости, поместите ткань поверх нее. Не проталкивайте ткань глубоко в ОКТ. Дайте ткани посидеть на ней до полного замерзания, что займет 1–2 минуты.
- Поместите «патрон» с замороженным ОКТ и ткань в режущую руку криостата. Отрегулируйте салфетку так, чтобы она была на одном уровне с режущим лезвием.
- Дайте ткани постоять в режущей руке в течение 15–20 минут, чтобы привыкнуть к новой температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от толщины ткани, требуется время для температурной акклиматизации. Дайте ткани постоять столько, сколько требуется для чистого разреза. Отрегулируйте ОТ и КТ, чтобы помочь тканевой температурной акклиматизации.
- Медленно переместите ткань ближе к лезвию. Как только ткань достигнет лезвия, приступайте к процессу обрезки. Толщина обрезки должна быть установлена на 30 мкм.
- Обрежьте в 2–3 раза, пока не станут видны слои коры головного мозга.
- Поместите и выровняйте пластину для предотвращения кренов чуть выше лезвия криостата.
ПРИМЕЧАНИЕ: Серебряная линия появится от света в криостате на стыке лезвия и пластины для предотвращения крена. Это указывает на то, что пластина против крена находится непосредственно над краем лезвия.
- Начинайте резать срезы с 14 мкм. Правильно вырезанные участки будут плоскими под пластиной антикрена.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если салфетка застряла, убедитесь, что пластина с защитой от крена достаточно холодная. При необходимости положив кусок сухого льда снаружи (стороной, не касающейся сцены), вы быстро охладите пластину, препятствующую крену.
- Разрежьте 4–6 секций и выровняйте их горизонтально по всей стадии криостата.
- Наклоняя предметное стекло, подхватывайте все кусочки ткани за один раз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используя щетки, поднимите концы салфетки, чтобы сделать их более доступными для предметного стекла при поднятии. Не берите по одному разделу за раз. Воздействие воздуха комнатной температуры ухудшает целостность РНК.
ВНИМАНИЕ: Не позволяйте мембране соприкасаться со ступенью криостата. Если мембрана коснется предметного стекла, она начнет отделяться от предметного стекла и вызовет ошибки при попытке ЖКМ.
- Немедленно переходите к шагу 6. Не стоит затягивать с фиксацией.
2. Фиксация тканей/визуализация без пятен
- Немедленно переходим к протоколу фиксации этанола
- Поместите предметное стекло в держатель предметного стекла с 70% этанолом на 2 минуты — на лед.
- Поместите предметное стекло в держатель предметного стекла с 95% этанолом на 45 с — на лед.
- Поместите предметное стекло в держатель предметного стекла со 100% этанолом на 2 минуты — при температуре RT.
- Опустите предметное стекло 3 раза в держатель предметного стекла с ксилолом 1 — в режиме RT.
- Поместите предметное стекло в держатель слайда с ксилолом 2 на 5 минут — при RT.
- Дайте высохнуть в чистом месте не менее 30 минут. Оптимальным является более длительное время сушки, до 60 минут.
ВНИМАНИЕ: Используйте стоячие слайды для сушки в вытяжном шкафу. Ксилол летуч. Плоская укладка предметных стекол приведет к скоплению ксилола в тканевой части, что сделает ткань слишком темной.
3. Размораживание сохраненных слайдов для использования
- Извлеките трубку с помощью одного предметного стекла из морозильной камеры при температуре -80 °C за 1 час до использования по назначению.
- Не открывайте трубку сразу. Дайте трубке нагреться до комнатной температуры. Конденсация будет происходить только на внешней стороне трубки.
- Как только трубка нагреется до комнатной температуры и весь конденсат уйдет (примерно через 30–40 минут), снимите крышку и подставьте предметное стекло на воздух комнатной температуры.
- Дайте горке акклиматизироваться до комнатной температуры в течение 15–20 минут. Затем оставьте его внутри тюбика со снятой крышкой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Слайд теперь готов для LCM.
4. Лазерная микродиссекция клеток Пуркинье:
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе протокола будут обсуждаться только особенности, связанные с захватом клеток Пуркинье для последующего секвенирования РНК. В этом разделе предполагается, что пользователь знаком с УФ-лазерным микроскопом и связанным с ним программным обеспечением.
- Очистите предметный столик микроскопа и рукав для сбора колпачков с помощью обеззараживателя РНКазы.
- В руках в перчатках поместите предметное стекло на микроскоп и непрозрачный колпачок объемом 500 л в кронштейн для сбора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда проверяйте правильную технику РНК, очищая рабочую зону деконтаминатором РНКазы и используя руки в перчатках при прикосновении к затвору или непрозрачному колпачку. Перчатки можно снять, как только затвор и колпачок будут на месте и начнется лазерный захват.
- При малом увеличении совместите непрозрачный колпачок над мозжечковой тканью, следя за тем, чтобы колпачок охватывал всю область, визуализируемую в окуляре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Только окуляр микроскопа будет показывать, отцентрирован ли непрозрачный колпачок. Камера не покажет, расположен ли колпачок по центру ткани. В зависимости от конструкции лазерного прицела визуализация через непрозрачный колпачок будет осуществляться либо только в окуляре, либо визуализироваться как в окуляре, так и в камере.
- Визуализируйте слои мозжечка с помощью объектива 5-кратного - 10-кратного увеличения и наведите курсор на участок, где пересекаются молекулярный слой и слой гранулярных клеток (слой клеток Пуркинье).
- Перейдите к 40X и визуализируйте клетки Пуркинье.
ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите Рисунок 1 и Рисунок 2 для визуализации.
- Начните захват клеток Пуркинье.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для проведения секвенирования РНК требуется не менее 5 нг РНК. Примерно 1600–2000 клеток Пуркинье дают достаточно материала РНК для секвенирования. РНК будет стабильна до 8 часов под микроскопом. Перед сбором проверьте УФ-энергию и фокусировку УФ-излучения, чтобы убедиться в правильности уровней. Со временем ткань будет продолжать высыхать, и может потребоваться изменить ультрафиолетовую энергию и УФ-фокус.
