$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.
1. Хранение мозгов
- Быстро удалите мозг у усыпленных взрослых мышей дикого типа CD1 весом около 30 г с помощью традиционного подхода и заморозьте их на 60 секунд в жидком азоте или изопентане, предварительно охлажденном сухим льдом.
- Храните замороженные мозги при температуре -80 °C в алюминиевой фольге или конических тубах до использования.
2. Подготовка матрицы мозга
- За двадцать четыре часа до препарирования тканей поместите чистую мозговую матрицу на стопку размороженных пакетов из морозильной камеры. Проложите боковые стороны матрицы между двумя пакетами для морозильной камеры, стараясь оставить примерно 0,5 см между нижней частью прорезей для бритвы и верхней частью гелевых пакетов (Рисунок 1A). Поместите алюминиевую фольгу на концы, чтобы облегчить охлаждение.
ПРИМЕЧАНИЕ: При покупке матрицы мозга покупайте ту, которая достаточно велика, чтобы охватить весь объем мозга, подлежащего препарированию.
- Поместите коробку с матрицей мозга и морозильными пакетами в морозильную камеру при температуре -20 °C с приоткрытой крышкой на ночь.
3. Установка замороженной стеклянной тарелки
ПРИМЕЧАНИЕ: Цель этой установки - подготовить замороженную поверхность для препарирования участков мозга.
- Поместите лед в изолированный ящик примерно на расстоянии до 5 см от верха. Затем положите слой сухого льда толщиной 2,5 см поверх льда и накройте черной пластиковой пленкой, чтобы облегчить визуализацию образца (Рисунок 1B, Рисунок 1C).
- Поместите стеклянную тарелку (которая должна как раз помещаться в отверстие коробки) поверх пластика и положите сухой лед поверх тарелки в дальних углах (Рисунок 1C).
- Достаньте замороженную мозговую матрицу из морозильной камеры и вставьте в нее разрезанный мозг корой вверх. Дайте ему уравновеситься до температуры в коробке в течение 10 минут. В течение этого времени держите коробку закрытой крышкой.
- Отрегулируйте положение мозга в матрице с помощью холодных щипцов так, чтобы сагиттальный синус и поперечный синус совпадали с перпендикулярными бороздками блока (Рисунок 1D). Это поможет обеспечить симметричные сечения для более легкого рассечения. Прикоснитесь кончиками щипцов, чтобы ненадолго высушить лед, чтобы охладиться, прежде чем настраивать мозг.
- Как только мозг встанет на место, поместите охлажденное лезвие бритвы рядом с его центром и вдавите лезвие примерно на 1 мм в ткань. Добавьте охлажденные лезвия на ростральный и каудальный концы, чтобы помочь удерживать мозг на месте (Рисунок 2A и Рисунок 2B).
- Начиная с рострального конца, добавляйте лезвия по одному, помещая их в пазы и осторожно вдавливая их в ткань примерно на 1 мм (Рисунок 2B). Продолжайте добавлять лезвия с интервалом в 1 мм, двигаясь к хвостовому концу.
- Следите за тем, чтобы мозг не смещался в течение этого времени. Выровняйте лезвия горизонтально и вертикально (Рисунок 2B). Низкопрофильные лезвия микротома могут использоваться для резки секций шириной 0,5 мм. Поместите их между большими бритвенными лезвиями (Рисунок 2C).
- Как только лезвия будут на месте, надавите на верхнюю часть группы пальцами, ладонью или другой плоской поверхностью (Рисунок 2C, Рисунок 2D). Медленно покачивайте группу лезвий из стороны в сторону, чтобы провести их по тканям.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это может занять некоторое время (1–2 минуты) и требует терпения. Должно быть сопротивление лезвиям, проходящим через ткани. Легкий вход означает, что мозг оттаивает и блок следует охладить сухим льдом.
- Когда все лопасти достигнут дна пазов, возьмитесь за каждую сторону группы лопастей и раскачивайтесь вперед и назад, чтобы освободить матрицу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдайте осторожность, чтобы не порезаться об острые края лезвий.
- Как только группа освободится, поместите стопку ростральной стороной вверх на стеклянную пластину (Рисунок 2E). Положите сухой лед рядом со стопкой и/или поверх нее, чтобы еще больше заморозить образцы для более легкого разделения.
- Положите стопку острыми краями вниз на стеклянную пластину и разделите лезвия, переложив стопку между большими и указательными пальцами. Лопасти должны отделяться друг от друга с прикрепленными секциями.
- Выровняйте секции на стеклянной пластине от рострального к каудальному (Рисунок 2F).
- Отделите ткани от лезвий, согнув лезвия между пальцами, или отделив их второй холодной бритвой (Рисунки 2G, 2H, 2I).
4. Разбор разделов
- Откройте Атлас мозга мыши Аллена или другой справочник и найдите ориентиры, необходимые для определения областей интереса. Некоторые очевидные ориентиры включают переднюю спайку, мозолистое тело, боковые желудочки и гиппокамп (Рисунок 3).
- Переверните разрезаемый участок охлаждаемыми щипцами и убедитесь, что область, которую нужно собрать, одинакова по всему телу. Во время уборки урожая часто сверяйтесь с эталонным атласом, чтобы убедиться в правильном ROI.
ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличительное стекло или анатомический микроскоп часто помогают в этом процессе. Хорошее освещение также имеет важное значение. Для этой цели можно использовать светодиодные лампы низкой мощности или холодную лампу.
- Чистым скальпелем или перфоратором разрежьте в секции (Рисунок 4). Предварительно охладите каждый инструмент перед резкой, кратковременно прикоснувшись к нему до сухого льда. Осторожно, но сильно вдавите лезвие в ткань, раскачивая его вперед и назад, чтобы сделать надрез. Не давите слишком сильно, иначе ткань сломается.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инструменты со временем нагреваются. Слегка нагретые лезвия могут помочь сделать чистые надрезы и ограничить трещины, но будьте осторожны, чтобы не оттаять ткань. Периодически охлаждайте инструменты на сухом льду.
- После того, как ROI будет собран, поместите его в промаркированные, предварительно охлажденные пробирки объемом 1,5 мл. Храните собранные салфетки при температуре -80 °C до тех пор, пока они не понадобятся.
