Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.
1. Бактериологическое исследование межпозвоночных дисков (IVD) и нагрузка
- Перенесите межпозвоночные диски (МВД) в камеры ИВД и добавьте питательную среду для ИВД (модифицированная среда Dulbecco's Eagle Medium (DMEM, 4,5 г/л DMEM с высоким содержанием глюкозы для физиологической группы и 2 г/л DMEM с низким содержанием глюкозы для патологической группы) + 1% пенициллин/стрептомицин + 2% сыворотка плода теленка + 1% ITS (содержит 5 мкг/мл инсулина, 6 мкг/мл трансферрина и 5 нг/мл селеновой кислоты) + 50 мкг/мл аскорбат-2-фосфата + 1% заменимой аминокислоты + 50 мкг/мл антимикробного средства для первичных клеток) и поместить в инкубатор при 37 °C, 85% влажности и 5% CO2.
- Культивировать диски в течение 4 суток в биореакторной системе по опытным группам. В патологической группе поддерживают условия дегенеративной нагрузки на уровне 0,32-0,5 МПа, 5 Гц в течение 2 ч/сут. В группе физиологического контроля используют протокол нагрузки 0,02-0,2 МПа, 0,2 Гц в течение 2 ч/сут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Установите IVD в камеры, содержащие 5 мл среды IVD во время процедуры загрузки. Объем зависит от размера загрузочных камер биореактора. Между нагрузочными процедурами поместите IVD в шестилуночные планшеты с 7 мл питательной среды IVD для восстановления свободно набухающего.
- Для анализа изменения высоты диска в течение экспериментального периода измеряют высоту диска штангенциркулем после ИВД (исходный уровень), а затем ежедневно после периода свободного набухания и после динамической нагрузки в течение всего периода эксперимента.
2. Внутридисковое введение фактора некроза опухоли-альфа (TNF-α)
- Сразу после первого цикла динамической нагрузки в 1-й день поместите IVD в чашку Петри в вертикальное положение и стабилизируйте IVD с помощью пинцета.
- Вводят рекомбинантный ФНО-α (100 нг в 70 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS) для ИВД) с помощью иглы инсулина 30-го калибра в пульпозное ядро патологической группы. Медленно впрыскивайте со скоростью около 70 μл в течение 1 мин.
- После инъекции оттяните шприц на полпути назад внутрь IVD и потяните поршень шприца, чтобы создать вакуум, предотвращающий утечку введенного раствора обратно, прежде чем полностью извлечь иглу и шприц из IVD.
ПРИМЕЧАНИЕ: Проведите пилотный эксперимент путем введения PBS, содержащего трипановый синий краситель, чтобы оценить распределение введенного раствора после загрузки и ночного культивирования.
