Индукция черепно-мозговой травмы у модели крысы с помощью устройства для латеральной перкуссии жидкости

Аннотация

Источник: McGuire, M. J., et al. использование беспроводной видео-ЭЭГ-системы для мониторинга эпилептиформных разрядов после черепно-мозговой травмы, вызванной латеральной перкуссией жидкости. J. Vis. Exp. (2019)

Это видео демонстрирует индукцию черепно-мозговой травмы (ЧМТ) у крысы с помощью устройства для боковой перкуссионной травмы жидкостью (FPI). Процедура включает в себя создание отверстия в черепе крысы, находящейся под наркозом, чтобы обнажить твердую мозговую оболочку, к которой прикреплена канюля. Затем крысу подключают к устройству, которое генерирует волну давления, достигающую мозга, имитируя ЧМТ, вызывая гибель нервных клеток и повреждение сосудов

Протокол

1. Ударная травма жидкостью

1. Наденьте лабораторный халат или хирургический халат, хирургическую маску, хирургические перчатки и головной убор и стерилизуйте все инструменты и материалы, которые контактируют с местом операции.
2. Обезболите 10-12-недельного самца крысы линии Вистар (350-400 г) 3% изофлураном и 1 л/мин кислорода в индукционной камере, подходящей для крыс. Извлеките крысу из индукционной камеры и переместите ее в зону подготовки, как только она потеряет сознание. Закапывайте стерильную офтальмологическую мазь в оба глаза.
3. Сбрейте шерсть на голове крысы с помощью электрической машинки для стрижки с лезвием #40 прямо над глазами до каудального основания ушей, чтобы создать достаточное хирургическое поле. Удалите с участка все выпавшие, подстриженные волосы.
4. Очистите место операции, нанеся на выбритую кожу головы 2% хлоргексидиновый скраб, а затем 70% этанол. Начните с центра и двигайтесь наружу концентрическими кругами от места разреза. Повторите этот процесс 3 раза. Нанесите раствор Бетадина на участок таким же образом и дайте ему высохнуть.
5. Поместите крысу под наркозом в стереотаксическую рамку и поддерживайте анестезию на уровне 2-3% изофлурана-1 л/мин кислорода через носовой конус. Проверьте на потерю рефлекса отмены задней конечности и потерю глазного рефлекса, чтобы убедиться, что крыса находится в операционной плоскости анестезии.
6. Контролируйте частоту дыхания, частоту сердечных сокращений, температуру тела и насыщение кислородом на протяжении всей операции. Поддерживайте частоту сердечных сокращений в диапазоне 300-400 уд/мин и SpO₂ выше 90%.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пульсоксиметр, прикрепленный к задней ноге, может быть использован для обеспечения постоянного считывания частоты сердечных сокращений и SpO₂. Частота сердечных сокращений выше 400 ударов в минуту указывает на то, что крыса недостаточно обезболивается. Саморегулирующаяся грелка в сочетании с ректальным термометром, установленным на 37 °C, может быть размещена под крысой на протяжении всей операции для поддержания температуры тела. Стереомикроскоп с источником света в сочетании с оптоволоконной лампой полезны для визуализации процедуры.
7. С помощью иглы 23 г введите 0,5% бупивакаина гидрохлорида внутрикожно в кожу головы в месте разреза для местной анальгезии за 10-15 минут до разреза.
8. Сделайте разрез по средней линии 1,5-2,5 см через кожу головы и мышцы головы с помощью лезвия скальпеля #10. Втяните кожу и мышцы, чтобы обнажить череп и обеспечить чистое операционное поле. Отведите подлежащую фасцию и жировую ткань от кости стерильными ватными тампонами.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Электрическое устройство прижигания полезно для достижения быстрого гемостаза.
9. Сбрейте латеральный гребень левой теменной кости с помощью хирургической кюретки, чтобы получить гладкую плоскую поверхность, чтобы основание женско-женского узла замка Луэра могло находиться заподлицо с черепом.
10. Орошайте поверхность черепа и окружающие ткани раствором гентамицина в концентрации 2,0 мг/мл в стерильном физрастворе. Промокните излишки раствора стерильным тампоном.
11. Нанесите 3% перекись водорода на череп, чтобы высушить кость.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если кость недостаточно сухая, стоматологический цемент не прилипнет должным образом и не образует прочную пломбу.
12. Создайте место краниэктомии диаметром 5 мм через левую теменную кость.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Трепан, помещенный в электродрель, прикрепленную к стереотаксической раме, может быть полезен для начала краниэктомии. С помощью ручной дрели с трепаном диаметром 5 мм медленно завершите краниэктомию через оставшуюся кость. Когда трепан близок к завершению краниэктомии, поверните трепан в обратном направлении, чтобы предотвратить разрыв нижележащей твердой мозговой оболочки. Произойдет истончение черепа по периметру диска, и лоскут черепа будет ощущаться ослабленным при легком надавливании.
13. Снимите костный лоскут с помощью хирургической кюретки и щипцов для гладких тканей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Может возникнуть некоторое кровотечение, но гемостаз может быть быстро достигнут путем мягкого надавливания стерильными ватными палочками.
14. Используйте стереомикроскоп и осветительные приборы, чтобы визуально осмотреть твердую мозговую оболочку на наличие признаков разрыва. Тонкий ободок кости останется по окружности места краниэктомии. Аккуратно удалите этот ободок с помощью щипцов из гладкой ткани, стараясь не разорвать твердую мозговую оболочку.
15. Промокните череп 70% этанолом, чтобы удалить костную пыль и высушить череп.
16. Нанесите тонкий слой цианоакрилатного гелевого клея вокруг нижнего края втулки замка Люэра и закрепите его на черепе над местом краниэктомии, не препятствуя открытию. Соблюдайте осторожность, чтобы клей не соприкасался с твердой мозговой оболочкой. Далее запечатайте замок Люэра на месте с помощью дополнительного тонкого слоя клея вокруг внешнего основания ступицы.
17. Приготовьте кашу из стоматологического цемента. Нанесите цемент на поверхность черепа вокруг и над основанием ступицы замка Люэра, чтобы закрепить его на месте.
18. С помощью шприца и иглы заполните ступицу замка Люэра стерильным раствором искусственной спинномозговой жидкости (СМЖ) без консервантов (pH 7,4) так, чтобы над верхней частью обода был виден выпуклый комок физиологического раствора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор сохранит твердую мозговую оболочку влажной по мере высыхания стоматологического цемента, а также служит признаком целостности пломбы. Если уровень раствора совсем не падает, это признак утечки в системе, и замок Люэра необходимо снять и заменить.
19. Как только стоматологический цемент полностью затвердеет, прекратите газовую анестезию и извлеките крысу из стереотаксической рамы.
20. Поместите крысу на платформу рядом с устройством FPI.
21. Устройство FPI имеет изогнутый металлический наконечник, который выступает от датчика давления в конце резервуара для жидкости. Закрепите напорную трубку длиной 12 см на конце изогнутого наконечника так, чтобы противоположный конец заканчивался поворотным соединителем Luer с наружной резьбой 2 см. Закрепите крысу на устройстве FPI, подключив женский конец концентратора на черепе крысы к мужскому разъему.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что соединение надежно закреплено и что все пузырьки воздуха удалены из системы.
22. Поместите животное в лежачее положение на грудине и многократно проверьте наличие рефлекса отмены. Как только у крысы восстановится рефлекс отмены, но она все еще будет находиться под действием седативных препаратов, отпустите маятник устройства FPI, чтобы вызвать один импульс давления продолжительностью 20 мс и вызвать травму.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно не вызывать травму, пока животное находится под глубоким наркозом, так как это имеет тенденцию вызывать повышенную смертность из-за нейрогенно-индуцированного отека легких. Все устройства демонстрируют вариативность. Однако на устройстве, используемом для этого эксперимента, установка молотка под углом 17° создает импульс атмосферного давления 2,2 - 2,3. Нетравмированные, бутафорские животные подвергаются всем тем же процедурам, за исключением фактического импульса жидкости до индуцированной травмы.
23. Немедленно отключите крысу от устройства FPI после травмы, поместите ее в лежачее положение на грудине и подайте дополнительный кислород (1 л/мин) через носовой конус до тех пор, пока не вернется спонтанное дыхание. Апноэ является ожидаемым последствием травмы. При необходимости обеспечьте периодические ручные вдохи через маску с клапаном мешка до тех пор, пока крыса не начнет самопроизвольно дышать самостоятельно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, апноэ длится менее 2 минут. Преходящее быстрое повышение частоты сердечных сокращений (>500 уд/мин) наблюдается сразу после введения импульса давления из-за взрыва катехоламинов. Это можно контролировать с помощью пульсоксиметра, прикрепленного к лапке крысы, и это может служить возможным индикатором того, что произошла серьезная травма.
24. Непрерывно наблюдайте за крысой и записывайте время восстановления выпрямляющего рефлекса (стабильного передвижения на всех четырех конечностях).
25. Амплитуда импульса атмосферного давления для каждой крысы должна находиться в пределах ± 0,05 атмосфер друг от друга. Убедитесь, что каждый из импульсов давления выдает на осциллографе плавный сигнал с постоянной амплитудой и длительностью.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шумный сигнал может указывать на пузырьки воздуха в системе, которые необходимо удалить перед подачей импульса травмы. Импульсы атмосферного давления, которые приводят к серьезным травмам, в этом эксперименте обычно приводят к тому, что время выпрямления животного составляет 30-60 минут. Этот диапазон времени коррекции связан с уровнем смертности примерно 40-50%.
26. Введите 10 мл предварительно подогретого физиологического раствора подкожно в качестве поддерживающей терапии.
27. Верните крысу в ее домашнюю клетку и дайте ей восстановиться не менее 4 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Повышенная смертность наблюдается, когда крыс немедленно помещают обратно под наркоз.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Сверла 1,00 мм	Drill Bit City: новые твердосплавные инструменты	05М200
Карбоксилатный цемент 3M ESPE Durelon	3M , Нойс, Германия	No 38019	Стоматологический цемент
4-0 Шов	Ethicon, Соммервилль, Нью-Джерси	К831Х	4-0 Ethicon Perma-hand Silk, 26 мм 1/2c Taperpoint, 30 дюймов (75 см), черный плетеный нерассасывающийся шов
Трепан с наружным диаметром 5 мм	Инструменты для точной науки	18004-50
Щипцы Dumont #6	Инструменты для точной науки	11260-20
Щипцы Dumont #7b	Инструменты для точной науки	11270-20
ecgauto	EMKA Technologies, Фоллс-Черч, Вирджиния
Внутренняя муфта с резьбой Luer Прозрачная поликарбонатная	Инструмент Коула-Палмера	СКО#45501-22	Заказать лот #214271
Ножная электродрель	Гробет США, Карлштадт, Нью-Джерси	Модель С-300
GentaMax 100 (Гентамицин, раствор сульфата)	Феникс, производитель ООО «Клиппер Дистрибьюринг Компани», ул. < /> Джозеф, Миссури		НДЦ 57319-520-05
Hill's Prescription Diet a/d Canine/Feline	Hill's Pet Nutrition, Inc., Топика, Канзас-Сити
Программное обеспечение IOX2	EMKA Technologies, Фоллс-Черч, Вирджиния
Изофлоран, USP	Piramal Enterprise Limited, Андхра, Индия		НДЦ 66794-013-25
Аппарат для анестезии IsoTech	СургиВет	WWV9000
Боковое устройство FPI	Компания AmScien	302	Изогнутый наконечник, с удлинителем напорной трубки. Соединен с помощью винтового соединителя (Cole-Palmer; #4550-22)
Стереомикроскоп Leica A60	Leica Biosystems, Ричмонд, Вирджиния	Номер телефона: 10 450 488
Маркаин (0,5%) Бупивакаин гидрохлорид для инъекций usp 5 мг/мл	Хоспира, Лейк-Форест, Иллинойс	СА-3627	Флакон с несколькими дозами 50 мл; НДЦ 0409-1610-50
Щипцы Micro-Adson	Инструменты для точной науки	11018-12
Иглодержатели Olsen-Hegar с фрезами для швов	Инструменты для точной науки	12002-14
PALACOS R+G костный цемент с гентамицином	Герей,	ССЫЛКА: 5036964	Рентгеноконтрастный костный цемент, содержащий 1 х 0,5 г гентамицина
Раствор повидон-йода			Бетадин
Ветеринарная мазь Puralube	Дехра Ветеринарные Продукты, Оверленд Парк Канзас		НДЦ 17033-211-38
Лезвие скальпеля (#10) и держатель	Integra Miltex, Йорк, Пенсильвания	ССЫЛКА: 4-110
Рукоятка скальпеля - #4	Инструменты для точной науки	10004-13
Серповидный нож	Инструменты Bausch + Lomb Storz	Н1705 НМ	Изогнутое лезвие 5 мм. Ручка круглая. Общая длина 168 мм, 6,6 дюйма.
Микрозеркало Silverstein	Инструменты Bausch + Lomb Storz	Н1706 С8	Диаметр 3 мм. Угол 45 градусов. Общая длина 180 мм, 7,2 дюйма
Установка теплового прижигания	Geiger Medical Technology, Деласко Каунсил-Блаффс, Айова	Модель: 150
Ветивекс	Дехра Ветеринарные Продукты, Оверленд Парк Канзас		Ветеринарный pHyLyteTM для инъекций pH 7.4 (Впрыскивание нескольких электролитов, тип 1, USP)
Крысы Wistar IGS	Чарльз Ривер	Код штамма 003	12 недель на момент травмы
Вуллштейновский ретрактор	Инструменты для точной науки	17018-11