Получение суспензии одиночных клеток из замороженной ткани мозга крысы

Аннотация

Источник: Rubio, F. J., et. al. Флуоресцентная активированная сортировка клеток (FACS) и анализ экспрессии генов Fos-экспрессирующих нейронов из свежей и замороженной ткани мозга крысы. J. Vis. Exp. (2016)

В этом видео демонстрируется диссоциация замороженной ткани мозга крысы в одноклеточную суспензию с помощью ферментативного расщепления и механической растирания. Подготовленные клетки фиксируют и проникают этанолом для последующих применений, таких как проточная цитометрия или анализ экспрессии генов.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным обзором JoVE.

1. Подготовка перед забором тканей

1. Установите центрифугу на 4 ^oC.
2. Отполируйте огнем набор из трех стеклянных пипеток Пастера с уменьшающимся диаметром примерно 1,3, 0,8 и 0,4 мм для каждого образца.
3. Подготовьте промаркированные пробирки объемом 1,7 мл, содержащие 1 мл холодного буфера А, и держите пробирки на льду.
4. Подготовьте лоток для льда с матрицей для среза мозга, шпателями и стеклянными пластинами (или перевернутой стеклянной чашкой Петри), на котором будет проводиться вскрытие. Предварительно охладите два или более бритвенных лезвия на стеклянных пластинах и используйте салфетную бумагу для сушки всех инструментов, которые соприкасаются с тканью.
5. Разморозьте раствор фермента при комнатной температуре (RT) в течение 30 минут перед забором ткани.

2. Забор и вскрытие тканей

1. Поведенческое или фармакологическое лечение следует начинать за 90 минут до забора тканей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения показанных здесь результатов были проведены острые внутрибрюшинные инъекции 5 мг/кг метамфетамина крысам в новой среде (тестовые условия) и наивным крысам, содержащимся в их домашних клетках (контрольные условия).
2. Обезболите крысу, поместив ее в стеклянную банку с эксикатором с насыщенным изофлураном, и обезглавьте крысу через 30 - 60 секунд с помощью гильотины.
   С помощью ножниц удалите кожу и мышцы с головы и обнажите череп. С помощью ронжеров разрежьте череп, вскройте большое затылочное отверстие и удалите заднюю часть черепа. Используйте ронжеры для разреза по верхним краям черепа, чтобы обнажить мозг. Будьте осторожны, чтобы не повредить мозг. С помощью небольшого шпателя осторожно зачерпните под мозг и поднимите его. Поднимите мозг и разрежьте нервы, пока мозг не освободится.
3. Рассекайте ткани с помощью бритвенных лезвий.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Получите образцы тканей одним из следующих способов: (2.3.1) свежепрепарированная ткань; (2.3.2) замороженные ткани после вскрытия; или (2.3.3) замороженная ткань, препарированная из замороженного целого мозга. Держите матрицу для среза мозга, бритвенные лезвия и стеклянную пластину сухими на протяжении всего процесса вскрытия и измельчения, так как конденсированная вода может привести к гипотоническому лизису клеток. Используйте увеличительные стекла для обеспечения точного вскрытия.
   1. Для свежепрепарированной ткани поместите только что извлеченный мозг в матрицу для среза мозга (металлическую форму в форме мозга крысы с прорезями для бритвенных лезвий с интервалом в 1 мм), которая была охлаждена на льду. Вставьте два или более предварительно охлажденных бритвенных лезвия в пазы, чтобы вырезать корональные срезы, содержащие интересующие области мозга. Положите нарезанный ломтик на охлажденную стеклянную тарелку.
      Примечание: Препарируйте интересующие области мозга на охлажденной стеклянной пластине.
   2. Для замороженной ткани после вскрытия препарируйте интересующую область (области) мозга из срезов только что извлеченного мозга, аналогично описанному выше в пункте 2.3.1. Поместите рассеченную ткань в микротрубку и быстро заморозьте ткань, погрузив микротрубку в изопентан при температуре -40 ºC на 20 секунд. Храните рассеченную ткань в замороженном виде в морозильной камере при температуре -80 ºC до дальнейшей обработки.
   3. Для замороженной ткани немедленно заморозьте свежеизвлеченный мозг при -40 ºC изопентане и храните в герметичном пакете при -80 ºC до 6 месяцев.
      1. В день вскрытия поместите замороженный мозг в криостат, установленный при температуре примерно -20 ºC (не теплее -18 ºC) примерно на 2 часа, чтобы уравновесить температуру.
         ПРИМЕЧАНИЕ: При этой температуре мозги можно легко резать, в то время как гораздо более низкие температуры делают мозг слишком хрупким, чтобы его можно было безопасно резать.
      2. С помощью бритвенных лезвий отрежьте 1 - 2 мм корональные срезы замороженных мозгов в криостате. В условиях замораживания используйте затупленную иглу 12–16 калибра, чтобы получить пробивки ткани из этих срезов. Храните рассеченную ткань в замороженном виде до дальнейшей обработки.
   4. Добавьте 1-2 капли буфера А, чтобы покрыть рассеченную ткань перед измельчением. Удалите большую часть белого вещества из тканей с помощью двух бритвенных лезвий, чтобы предотвратить потерю нейронов во время оставшейся части процесса растирания. Если вы начинаете с замороженной ткани, то дайте ткани оттаять на холодной стеклянной пластине не более 1 минуты перед нанесением раствора Буфер А.
   5. Измельчите ткань по 100 раз в каждом ортогональном направлении лезвием бритвы на охлажденной стеклянной пластине. При измельчении держите лезвие бритвы вертикально к стеклянной пластине.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательный минчинг имеет решающее значение для всех этапов протокола.
   6. С помощью бритвенных лезвий переложите измельченную салфетку в микроцентрифужные пробирки, содержащие 1 мл холодного буфера А. Переверните пробирку 3 - 5 раз, чтобы сохранить весь фарш в растворе.

3. Диссоциация клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте осторожное перемешивание из конца в конец для всех следующих этапов. Не используйте вихревой смеситель и избегайте пузырьков воздуха, которые вызывают повреждение клеток.

1. Центрифугируйте пробирки с образцами при давлении 110 x g в течение 2 мин при 4 ºC. Выбросьте надосадочную жидкость. Медленно добавьте 1 мл холодного, только что размороженного раствора фермента (содержащего смесь протеолитических ферментов) вниз по внутренней стенке микропробирки. Сразу же всасывайте всю гранулу и аккуратно пипеткой вверх и вниз всего 4 раза пипеткой умеренно большого диаметра кончика, чтобы разогнать измельченную гранулу ткани.
2. Немедленно переверните микротрубки, чтобы предотвратить прилипание гранул ко дну, и инкубируйте образцы с перемешиванием из конца в конец в течение 30 минут при 4 ^oC.
3. После ферментативного разложения тканей центрифугируйте пробирки при 960 x g в течение 2 мин при 4 ºC. Удалите надосадочную жидкость и добавьте 0,6 мл холодного буфера A. Сразу после добавления буфера A используйте тот же наконечник для дозатора для диспергирования гранулы, всасывая всю гранулу, и осторожно пипетируйте вверх и вниз 5 раз.
4. Механически растирайте переваренную ткань и соберите в пробирки по 15 мл, выполнив следующие действия. Для каждого образца используйте отдельный набор из 3 пипеток Пастера из полированного огнестрельного стекла с убывающим диаметром примерно 1,3, 0,8 и 0,4 мм, прикрепленных к латексным лампам.
   1. Аккуратно разрастите каждый образец 10 раз с помощью стеклянной пипетки диаметром 1,3 мм. Дайте образцу осесть на льду в течение 2 минут (мусор и недиссоциированные клетки осядут на дно). Соберите надосадочную жидкость (~ 0,6 мл) и переложите ее в коническую пробирку объемом 15 мл (туба #1).
   2. Добавьте 0,6 мл раствора Buffer A к оставшейся грануле. Измельчите образец 10 раз с помощью стеклянной пипетки диаметром 0,8 мм. Дайте образцу отстояться на льду в течение 2 минут. Соберите надосадочную жидкость (~0,6 мл) и переложите ее в ту же коническую пробирку объемом 15 мл #1.
   3. Добавьте 0,6 мл раствора Buffer A к оставшейся грануле. Измельчите образец 10 раз с помощью стеклянной пипетки диаметром 0,4 мм. Дайте образцу отстояться на льду в течение 2 минут. Соберите надосадочную жидкость (~0,6 мл; не трогая гранулу с недиссоциированными клетками) и переложите в ту же коническую пробирку объемом 15 мл #1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Держите пипетку диаметром 0,4 мм в пробирке #1 для следующих этапов растирания.
   4. Повторите шаг 3.4.3 еще три раза, используя самую маленькую стеклянную пипетку (диаметр ~0,4 мм), и соберите надосадочную жидкость в отдельную коническую пробирку объемом 15 мл (пробирка #2).
   5. Собранные клеточные суспензии разтереть в пробирках #1 и #2 еще 10 раз с помощью стеклянной пипетки 0,4 мм и держать их на льду.

4. Фиксация клеток и пермеабилизация

1. Приготовьте 4 микропробирки на образец (две микропробирки для клеток из пробирки #1 и две для клеток из пробирки #2), добавив 800 мкл 100% холодного этанола (хранящегося при -20 ^oC перед использованием) в каждую пробирку и держите их на льду. Примечание: Конечная концентрация этанола составит 50%.
2. Нанесите ~ 800 мкл клеточных суспензий (из пробирки #1 и пробирки #2) в каждую из 4 пробирок, содержащих холодный этанол, и переверните пробирки, чтобы перемешать образцы.
3. Инкубируйте трубки на льду в течение 15 минут, переворачивая трубки каждые 5 минут.
4. После фиксации/пермеабилизации центрифугируйте пробирки при давлении 1700 x g в течение 4 мин при 4 ºC и выбросьте надосадочную жидкость. Оставьте 50 мкл раствора для предотвращения потери клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Гранулы на этой стадии белые и меньше прилипают к стенкам пробирок, чем до пермеабилизации. Поэтому осторожно удаляйте надосадочную жидкость, касаясь стенки микротрубки, где нет гранулы, и медленно набирайте надосадочную жидкость с помощью микропипетки.

5. Фильтрация клеток

1. Повторно суспендируйте гранулы с шага 4.4 с холодным PBS следующим образом:
   1. Добавьте 550 μл холодной PBS в одну из двух микропробирок, поступающих из пробирки #1, и с помощью наконечника пипетки умеренного диаметра аккуратно пипетируйте клеточную суспензию вверх и вниз 5 раз. Повторите то же самое для одной микропробирки, выходящей из пробирки #2.
   2. Для клеток из пробирки #1 с помощью той же пипетки перенесите суспензию первой клетки на вторую гранулу. Повторно суспендируйте вторую гранулу, аккуратно пипетируя комбинированную клеточную суспензию вверх и вниз 5 раз.
   3. Для клеток из пробирки #2 ресуспендируйте и объедините гранулы (т.е., третью и четвертую микротрубки), как описано в 5.1.2.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Матрица мозга	CellPoint Scientific	69-2160-1	Для получения корональных срезов мозга
Гибернация Низкая флуоресценция	Биты мозга	HA-lf	Буфер А' в протоколе используется для обработки тканей и клеток от диссоциации до этапов фиксации
Accutase	Миллипор	SCR005	Ферментный раствор' в протоколе используется для ферментативного переваривания тканей перед растиранием
Сетчатый фильтр, 40 мкм	BD Falcon	352340	Чтобы отфильтровать клеточную суспензию
Сетчатый фильтр, 100 μм	BD Falcon	352360	Чтобы отфильтровать суспензию клеток
Falcon 5 мл полистирольная пробирка с круглым дном и защелкивающимся колпачком для ячеек	BD Bioscience	352235	Для фильтрации клеточной суспензии перед прохождением через проточный цитометр
Пастер Пипет, Стекло	Предложение NIH	6640-00-782-6008	Чтобы сделать растирание тканей