$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Микросмешения Реакция РТ
- Перед выполнением реакции РТ с микросмешения, равновесие micromixer до нужной температуры реакции РТ.
- Место micromixer внутри 37 ° С (или температуры, рекомендованной поставщиком RT) инкубатор, по крайней мере за 1 час до начала реакции РТ.
- Настройка смесь РТ по обратной транскриптазы поставщиком (например, MMTV-РТ от Promega, Omniscript от Qiagen) инструкции, за исключением использования одноклеточных количество входных общей РНК (например, 0.1-1pg/μl), вместо того, нг-мкг суммы, рекомендованные поставщиками.
- Мы используем стандартные стерильные, без нуклеазы 200 мкл тонкостенные пробирки для ПЦР.
- Позиция RT трубы надежно в micromixer, как только они будут готовы для смешивания. Micromixer должны оставаться внутри 37 ° C инкубатор для продолжительности реакции РТ.
- Выберите соответствующую частоту и амплитуду микросмешения. В этом примере мы используем 150 Гц.
- Переключатель на micromixer и оставьте на весь период реакции RT (60 минут).
- Коммутатор micromixer выходные и принять RT трубы один раз реакция РТ завершена.
- Место RT трубы на льду и продолжать как обычно с дальнейшими приложениями, такими как количественной полимеразной цепной реакции (КПЦР или ПЦР в реальном времени).
2. Представитель Результаты:
Благо микросмешения в контексте реакции РТ увеличение кДНК доходность по сравнению с другими, когда смешение методов (например, дрожь, вортексе или растирания) используются. Это видно, например, при последующем анализе кДНК с использованием количественных полимеразной цепной реакции (КПЦР или ПЦР в реальном времени). Рисунок 2А показывает последствия микросмешения за первые 5 минут (синий, "micromixed5") или всего 60 минут (красный, "micromixed60") по сравнению с растирания реакции RT непосредственно перед инкубацией РТ (черный, "растирание" ). В этом случае объем предыдущего реакции РТ было 25 мкл и в нем 2.5pg от общего числа РНК. КПЦР следы использованием праймеров, предназначенный для обнаружения кДНК представляющего Nurr-1 мРНК показано выше, а средние значения ± SEMs числа циклов для достижения 50% максимальной флуоресценции в 3-х повторений этого же эксперимента приведены ниже. Звездочка означает статистически значимых различий (в одну сторону дисперсионного анализа с Тьюки множественных сравнений). Обратите внимание, что микросмешения в течение первых 5 минут предыдущего реакции РТ производится незначительное улучшение по сравнению с растиранием в то время как микросмешения в течение всего 60 минут предыдущего реакции РТ производится значительное улучшение по сравнению с растиранием, величина которого была эквивалентна примерно 15 КПЦР циклов, в среднем.
Благо микросмешения также можно рассматривать в кривой плавления анализ последующих продуктов КПЦР получены. В эксперименте показано на рис 2B, микросмешения в течение всего 60 минут предыдущего реакции РТ в результате последовательного сигнала КПЦР в двух экземплярах образцов (рис. 2Ва, 2 красные следы), в то время как микросмешения в течение первых 5 минут или растирания производятся только несовместимы КПЦР следов (рис. 2Ва, 2 синих трасс и 2 черных следов, соответственно). Серые следы негативного контроля ("нег."), В котором кДНК осталась вне КПЦР реакции. Когда КПЦР продукты из этого эксперимента были денатурированного по наращивает их температуры (т.е. кривая плавления анализа) было очевидно, что соответствующие продукты ПЦР (т.е. ампликона, которая была идентична, что получается, когда более высокие концентрации мРНК обратной транскрипции и усиливается КПЦР, данные не приводятся) присутствовали только следующие реакции РТ, которые были micromixed в течение 60 минут (рис. 2BB, 2 красные следы). Все остальные (т.е. micromixed5, растиранием и отрицательный контроль), порожденный альтернативных продуктов ампликона (например, димеры праймеров).
Рисунок 1. Принципиальная схема протокола для применения микросмешения к стандартным лабораторным РТ реакций. Более подробное описание физического принципа участие, micromixer и как построить в доме micromixer предоставляются в ссылках 13,14
Рисунок 2. Представителю КПЦР данные, иллюстрирующие преимущества микросмешения применяется к предыдущему РТ реакции включает одноклеточные количества мРНК в противном случае стандартного лабораторного реакции РТ. Пример КПЦР следов обнаружения кДНК представляющего мРНК, кодирующей Nurr-1 гена. Предыдущий реакции РТ, содержащихся 2.5pg от общего числа РНК в объеме 25 мкл и проводились в инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 60 минут. RT реакции перемешивается растирания RТ смесь до инкубации (черные следы ", растиранием"), micromixed в течение первых 5 минут реакции RT (синие следы ", micromixed5") или micromixed в течение всего 60 минут реакции RT (красные следы ", micromixed60" ). Средства ± SEMs числа КПЦР циклов, необходимых для достижения 50% максимальной флуоресценции приведены ниже для п = 3 повторяет этого эксперимента. Asterisk указывает на значительную разницу (в одну сторону дисперсионного анализа с Тьюки множественных сравнений). В другом эксперименте КПЦР изучения Nurr-1 кДНК продукт, на этот раз следующие РТ реакции содержащие 25pg от общего числа РНК в объеме 25 мкл. КПЦР следы (), а также кривая плавления анализ продуктов КПЦР получены (б) показаны для различных условий перемешивания. Отрицательного контроля, в которых не кДНК была включена в предыдущий реакции РТ также включены (серые следы ", нег."). RT реакции с гораздо более высокой концентрации мРНК были выполнены также и производится кривой плавления пиков (данные не приведены) идентичны тем, которые в (б) для micromixed60 (красные следы) образцов.