$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.
1. Препарирование оболочек мозга мыши
- Обезглавите мышь с помощью гильотинного аппарата и быстро рассеките мозг (по возможности за <1 минуту, чтобы свести к минимуму изменения пальмитоилирования, которые могут возникнуть во время процедуры диссекции). Немедленно гомогенизируйте в 10 мл гомогенизационного буфера (Таблица 1) в стеклянном гомогенизаторе (~12 ударов) на льду.
- Центрифуга лизаты в течение 15 мин при 1 400 x g при 4 °C. Перенесите надосадочную жидкость в новую пробирку на льду. Повторно суспендируйте гранулу (~6 ходов) в равном объеме гомогенизационного буфера и центрифугируйте при 710 x g в течение 10 минут при 4 °C.
- Соедините надосадочную жидкость из стадии 1.2 и центрифугируйте при 40 000 x g в течение 20 мин при 4 °C.
- Выбросьте надосадочную жидкость (цитозольную фракцию) и повторно суспендируйте фракцию гранулированной мембраны (P2) в гомогенизационном буфере.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут быть мгновенно заморожены и храниться при температуре -80 °C для последующего использования.
- Проведите анализ бицинхониловой кислоты (БЦА) для количественного определения уровня белка. Для анализа Acyl-PEGyl exchange gel-shift (APEGS) начните с ~100−200 мг белка (максимум 250 мг) в объеме 470 мкл буфера A (Таблица 1) в пробирке объемом 1,5 мл. Ультразвуковую обработку и центрифугирование при >13 000 x g в течение 10 минут при 25 °C для удаления нерастворимого белка. Перенесите солюбилизированный белок в новую пробирку объемом 1,5 мл.
2. Анализ ацил-ПЭГилобменного гелеобразного сдвига (APEGS)
- Разрушает дисульфидные связи и блокирует свободные цистеины.
- Разрушать дисульфидные связи путем инкубации в 25 мМ трис(2-карбоксиэтил)фосфине (TCEP; 25 μL, добавленном из исходного раствора; Таблица 1) в течение 60 минут при 55 °C.
- Блокируют свободные цистеины 50 мМ N-этилмалеимидом (NEM; 12,5 μл, добавленным из исходного раствора; Таблица 1) при комнатной температуре в течение 3 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Реакция может быть продлена на ночь.
- Выполняют осаждение хлороформметанола (КМ).
- Перенесите белковый раствор из пробирки объемом 1,5 мл в полипропиленовую или стеклянную пробирку, которую можно центрифугировать в качающемся роторе ведра со скромной скоростью. Идеально подходит пробирка объемом 5 мл. Добавьте четыре объема (2 мл) метанола (MeOH) и быстро перемешайте.
- Добавьте два объема (1 мл) хлороформа и быстро перемешайте.
- Добавьте три объема (1,5 мл) деионизированной воды (dH2O) и кратко смешайте.
- Центрифугируйте образцы при давлении 3 000 x g в течение 30 мин при 25 °C в вращающемся роторе ковша.
- Аккуратно снимите и выбросьте верхнюю фазу.
- Добавьте 3 объема (1,5 мл) MeOH и осторожно, но тщательно перемешайте, стараясь не раздробить непрозрачный белковый блин.
- Центрифугируйте при давлении 3 000 x g в течение 10 мин при 25 °C в качающемся роторе ковша.
- С помощью стеклянной серологической пипетки удалите как можно больше верхней фазы, не нарушая белковый блин.
- Тщательно промойте гранулу 1 мл MeOH.
- Высушите гранулу на воздухе не менее 10 минут
ПРИМЕЧАНИЕ: Сушеные гранулы можно хранить при температуре -20 °C.
- Выполните расщепление пальмитоил-тиоэфирных связей гидроксиламином (NH2OH, HAM).
- Ресуспендируйте белок в 125 мкл буфера А и кратковременно обработайте ультразвуком. Центрифугируйте при >13 000 x g в течение 10 мин при 25 °C для удаления нерастворимого материала. Перенесите солюбилизированный белок в новую пробирку объемом 1,5 мл.
- Добавьте 375 мкл буфера H (HAM+; Таблица 1) или буфер T (HAM-; Таблица 1) и инкубировать образцы в течение 60 мин при 25 °C.
- Повторите осадки CM, описанные в шаге 2.2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сушеные гранулы можно хранить при температуре -20 °C.
- Добавьте mPEG к незащищенным цистеинам.
- Ресуспендировать гранулу в 100 мкл буфера А, содержащего 10 мМ TCEP. Переложите в пробирку объемом 1,5 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это нормально, если значительная потеря белка произошла во время стадий осаждения КМ. Все последующие этапы будут выполняться в пробирке объемом 1,5 мл, ограничивая объем белка максимум ~120−130 μл. Это снизит потери белка во время финального осаждения КМ.
- Добавьте 20 мМ mPEG-5k (25 μл, добавленный из исходного раствора; Таблица 1) в образец белка и смешать с помощью пипетирования. Инкубировать в течение 60 минут при температуре 25 °C с вращением из конца в конец.
- Чтобы удалить неинкорпорированный mPEG-5k, выполните осаждение CM, как описано в шаге 2.2, используя следующие скорректированные объемы: 4 объема MeOH (500 μл), 2 объема хлороформа (250 μл) и 3 объема dH2O (375 μл). Центрифуга при >13 000 x g в течение 10 мин при 25 °C.
- Осторожно удалите верхнюю фазу, как и раньше, избегая толстого флокулянтного блина. Добавьте 1 мл MeOH и аккуратно перемешайте. Центрифуга при >13 000 x g в течение 10 мин при 25 °C.
- Осторожно удалите надосадочную жидкость и промойте гранулу 1 мл MeOH. Центрифуга при >13 000 x g в течение 10 мин при 25 °C. Сухие гранулы на воздухе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сушеные гранулы можно хранить при температуре -20 °C.
- Суспендируйте высушенную гранулу в 50 мкл буфера А (без TCEP или какого-либо восстановителя).