Производство полимерных микрогранул, высвобождающих бета-амилоид, для моделирования болезни Альцгеймера

Аннотация

Источник: Almari, B., et al. Производство микрогранул альгината, секретирующих амилоид-β, для использования в моделировании болезни Альцгеймера. J. Vis. Exp. (2019).

В этом видео демонстрируется метод изготовления полимерных микрогранул, которые инкапсулируют нейротоксичные клетки, секретирующие бета-амилоид. Клеточно-полимерная суспензия обрабатывается с помощью устройства для изготовления микрогранул, при этом гелеобразование полимера достигается путем сшивания кальция, образуя сферические микрогранулы вокруг клеток. Полимер обеспечивает пролиферацию клеток, обеспечивая при этом контролируемое, долгосрочное высвобождение бета-амилоида, имитируя его накопление при болезни Альцгеймера.

Протокол

1. Подготовка

1. Приготовьте 100 мл ~4% (масс./об.) раствора альгината.
   1. Взвесьте 4,4 г альгинатной натриевой соли и добавьте сухой порошок в 100 мл HEPES-буферизованного физиологического раствора (HBS, 20 мМ гидроксиэтилпиперазина этановой сульфоновой кислоты [HEPES] (0,477 г) с 150 мМ NaCl (0,877 г) в деионизированной воде для увлажнения.
   2. Используйте магнитную мешалку со скоростью ~500 оборотов в минуту (об/мин) и нагрейте до 50 °C, чтобы обеспечить полное увлажнение альгината.
      заметка: Альгинату может потребоваться один или два часа, чтобы полностью увлажниться. Чтобы сэкономить время, раствор альгината можно приготовить за день до протокола инкапсуляции и хранить при температуре 4 °C до следующего дня. После охлаждения альгината осторожно нагрейте до 37 °C с помощью водяной бани или горячей плиты и перемешайте с помощью магнитной мешалки непосредственно перед использованием.
   3. Перед применением стерильно отфильтруйте раствор альгината с помощью фильтра из полиэфирсульфона (ПЭС) размером 0,22 мкм. Рекомендуется фильтровать при температуре 37 °C, чтобы обеспечить легкий поток альгината. Вязкость увеличится, если позволить температуре понизиться.
2. Приготовьте 1 000 мл 0,5 М CaCl₂.
   1. Весить 55,49 г безводного CaCl₂ и растворить в 1000 мл HBS (20 мМ HEPES и 150 мМ NaCl в 1000 мл деионизированной воды).
   2. Стерильный фильтр с использованием фильтра PES с порами 0,22 мкм.
3. Приготовьте 100 мл растворимой смеси.
   1. Приготовьте 100 мМ HEPES (23,83 г) и 500 мМ раствор дигидрата тринатрия цитрата (147,05 г) в фосфатно-солевом буфере.
   2. Отрегулируйте pH до 7,4 с помощью NaOH или HCl.

2. Настройка системы инкапсуляции

1. Очистите колпак с ламинарным потоком.
   1. Стерилизовать ламинарный проточный колпак, содержащий инкапсулятор, с помощью ультрафиолетового излучения с последующим распылением 70% v/v раствора этанола.
   2. Промойте систему инкапсулятора 10 мл 70% v/v раствора этанола, а затем 10 мл стерильной деионизированной воды.
   3. Присоедините сопло 300 μм и повторите шаг 2.1.2.
   4. Опрыскайте флакон, содержащий отфильтрованный раствор альгината, флакон, содержащий отфильтрованный раствор хлорида кальция, и любые инструменты, оборудование и пустые планшеты, которые будут использоваться, 70% v/v раствором этанола и поместите их в ламинарный колпак. Перед использованием снова включите ультрафиолетовый свет на 30 минут для тщательной стерилизации.
   5. Приготовьте стакан для отходов, наполненный дезинфицирующим раствором биологического качества, и поместите стакан в капюшон.
   6. Наполните стакан 100 мл стерильного раствора CaCl₂ (водный) и добавьте в магнитную мешалку. Установите скорость перемешивания на 100 об/мин. Поместите стакан на магнитную платформу на высоте 18 см от кончика насадки. Этот стакан будет использоваться для сбора альгинатных шариков и обеспечения их гелеобразования.
2. Подготовьте ячейки к инкапсуляции.
   1. Извлеките клетки из инкубатора и отсоедините от почти сливающейся колбы с помощью 0,25% раствора трипсин-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и инкубируйте при 37 °C в течение 5-10 минут.
   2. Выделите образец для оценки плотности клеток, а затем центрифугируйте оставшиеся клетки при 1000 об/мин в течение 5 минут для получения клеточной гранулы.
   3. Ресуспендировать гранулу в HBS (20 мМ HEPES и 150 мМ NaCl) для удвоения конечной желаемой концентрации клеток (например, для конечной концентрации 1,5 x 10⁶ клеток/мл ресуспендировать клетки в HBS для достижения концентрации 3 x 10⁶ клеток/мл).
   4. В центрифужной пробирке объемом 50 мл смешайте клеточную суспензию в соотношении 1:1 с ~4% (по массе) раствором альгината для получения окончательной суспензии, содержащей желаемую концентрацию клеток (например, 1,5 x 10⁶ клеток/мл) в ~2% (по массе/объему) растворе альгината.
3. Задайте параметры инкапсуляции.
   1. Установите скорость машины для инкапсулятора на максимальную скорость экструзии (8,9 мл/мин), напряжение на 1,0 кВ и частоту на 5 500 Гц.<бр/> заметка: Эти параметры были предварительно оптимизированы для получения микрогранул диаметром 550 мкм.

3. Изготовление

1. Изготовьте микрошарики.
   1. В шприц объемом 20 мл загрузите 5 мл суспензии клеточного альгината и присоедините шприц к капсулятору.
   2. Запустите инкапсулятор, активировав поток, который будет проталкивать клеточно-альгинатную суспензию через питатель. Струя капель будет выдавливаться через сопло.
   3. Соберите первый 1 мл в стакан для отходов, чтобы избежать начального неравномерного потока.
   4. Продолжайте выпускать оставшиеся 4 мл, позволяя каплям упасть в желировую ванну CaCl₂. Каждый миллилитр можно запускать отдельно (но последовательно) и при необходимости собирать в четырех разных гелеобразующих ваннах.
      заметка: При контакте с желирующей ванной альгинат в каплях мгновенно сшивается с ионами кальция в желирующей ванне и образует сферические микрошарики.
   5. Через одну минуту снимите стакан для гелеобразования с магнитной платформы и дайте микрогранулам постоять еще 4 минуты без перемешивания (время, необходимое для полного гелеобразования на микрогранулах при комнатной температуре).
2. Извлечение микрогранул.
   1. Удалите любой крупный альгинатный мусор или артефакты с помощью пары стерильных пинцетов, а затем с помощью стерильной пластиковой пипетки перенесите их в сетчатый фильтр размером 74 мкм, чтобы извлечь микрогранулы из ванны для гелеобразования.
   2. Перенесите микрогранулы в центрифужную пробирку с использованием соответствующей питательной среды и дайте им сбалансироваться в течение 5 минут в среде для культивирования клеток.
   3. Переложите в колбу, тарелку или чашку Петри для инкубации и дальнейших экспериментов.
      заметка: Гелеобразующую ванну нельзя использовать повторно.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0.22 um PES filter	Мерк, Великобритания	SLGP033RS
15 мм сетчатый фильтр Netwell 74 мкм	Констар, США	#3477
Натриевая соль альгиновой кислоты из бурых водорослей	Сигма-Олдрич,ук	А0682
Хлорид кальция	Сигма-Олдрич,ук	С1016
CellTiter96 AQueous One Solution Cell Prolsay	Promega, США	G3580
Инкапсулятор	Инотех	IE-50	Серийный номер 05.002.01-2005
ХЕПЕС	Сигма-Олдрич,ук	H4024
Фосфатно-солевой буфер	Сигма-Олдрич,ук	D1408
Хлорид натрия	Сигма-Олдрич,ук	433209
Дигидрат цитрата триспдия	Сигма-Олдрич,ук	W302600-K
Trypsin-EDTA solution	Сигма-Олдрич,ук	Т4049