$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры с участием животных были проверены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным обзором JoVE
Примечание: Начните с определения целевой популяции мышей. В предыдущих исследованиях использовались только самцы мышей дикого типа C57/Bl6. Тем не менее, также можно использовать различных трансгенных или нокаутных мышей. Обратите внимание, что стереотаксические координаты основаны на анатомии C57/Bl6. Рекомендуется, чтобы каждый пользователь изначально сверил локализацию штриха с белым веществом.
1. Индукция инсульта белого вещества - медиальный угловой доступ
- Начните с подготовки стеклянной пипетки с использованием капиллярной трубки диаметром 0,5 мм с дистальным диаметром от 15 до 25 мкм.
- Приготовьте стерильную аликвоту в 10 мкл L-Nio (N(5)-(1)-иминоэтил-L-орнитина гидрохлорида) в дозе 27,4 мг/мл (130 мкМ) в стерильном 0,9% физиологическом растворе.
- Предварительно наполните стеклянную пипетку небольшим объемом L-Nio (2-5 мкл), прикрепив стеклянную пипетку к трубке, подключенной к вакуумной линии. Положите пипетку на столешницу и вставьте вытянутый конец в раствор L-Nio.
- Подавайте вакуум до тех пор, пока не заполнится не менее 2 мм от 0,5 мм части пипетки. Выключите вакуум и извлеките пипетку. Отложите его в сторону до Шага 1.12.
- Поместите мышь в индукционную камеру и наведите анестезию мыши, используя стандартный 32% изофлуран, пропущенный через испаритель (5 л/мин при вдыхании 5 л/мин кислорода и 0,5 л/мин азота) в течение 1 минуты или до глубокой анестезии. Перенесите мышь в стереотаксический аппарат, оснащенный стереотаксическим микроскопом. Обеспечьте поддерживающую анестезию с помощью 32% изофлурана, пропущенного через испаритель (2 л/мин при вдыхании 5 л/мин кислорода и 0,5 л/мин азота) и носовой конус. Проверьте глубину анестезии с помощью зажима пальца ноги.
- Отрегулируйте инжекторный рычаг на 36°.
- Прикрепите стеклянный держатель для дозатора к дистальному концу системы впрыска под давлением малого объема и прикрепите его к рычагу для впрыска стереотаксической установки.
- Смажьте усы обезболенного животного вазелином и нанесите искусственную слезную мазь на оба глаза. Подготовьте стерильное операционное поле, наложив на голову животного стерильную простыню с отверстием 5-10 см над головой. Подготовьте асептическую хирургическую поверхность, сбрив шерсть над черепом. Очистите кожу головы чередованием бетадина и 70% спиртовых тампонов.
- Сделайте разрез по средней линии кожи головы на 1,5 см стерильными тонкими ножницами, чтобы обнажить поверхность черепа. Высушите череп стерильным ватным тампоном, а с помощью стереотаксического микроскопа с увеличением 1-3X удалите все вышележащие надкостничные ткани с помощью стерильного микроточечного инструмента.
- Отметьте Брегму в качестве точки отсчета с помощью маркера с тонкой точкой.
- Просверлите эллиптическую трепанацию черепа диаметром 2 мм с помощью стерильного хирургического сверла с тонким наконечником, начинающуюся сзади в Брегме и простирающуюся спереди слева от средней линии. Удалите костные фрагменты и вышележащие мягкие ткани, чтобы можно было визуализировать кору головного мозга.
- Поддерживайте операционное поле и поверхность коры головного мозга во влажном состоянии, периодически нанося капли стерильного физиологического раствора.
- Прикрепите вытянутую стеклянную пипетку к инжекторному рычагу стереотаксического аппарата. Совместите дистальный конец пипетки с брегмой и обнулите стереотаксические координаты.
- Переместите пипетку в первые передние/задние (A/P) и медиальные/боковые (M/L) координаты, указанные в таблице 1.
- Переместите пипетку к поверхности коры головного мозга и обнулите дорсальное/вентральное (D/V) измерение.
- Медленно вводите пипетку в мозг до тех пор, пока не достигнете первой координаты D/V, приведенной в таблице 1.
- Используя систему впрыска низкого объема, установленную на 20 фунтов на квадратный дюйм в течение 20 мс импульсов, введите 100 нл L-Nio в мозг и подождите 5 минут, чтобы предотвратить рефлюкс вверх по дорожке пипетки.
- Используйте калиброванную прицельную сетку в окуляре стереотаксического микроскопа и увеличение в 3 раза.
- Соответственно, сместите в общей сложности 0,100мм3 (0,5 мм длина в пипетке диаметром 0,5 мм, что соответствует 100 нл) от вытянутой стеклянной пипетки для каждого набора координат. С помощью прицельной сетки измеряйте и стандартизируйте, поскольку каждая настройка варьируется в зависимости от используемого увеличения и масштаба.
- Для точного измерения объема во время каждой инъекции подойдите к расположенной под углом пипетке с микроскопом сбоку так, чтобы воздушно-жидкостный мениск имел сагиттальный обзор. Мениск должен находиться в одной и той же фокальной плоскости как внутренней, так и внешней стенок пипетки.
- Медленно извлеките пипетку и повторите шаги 1.13-1.16.3 со вторым и третьим набором координат, приведенным в таблице 1.
- После заключительной инъекции извлеките пипетку и поместите достаточное количество костного воска, чтобы заполнить место трепанации черепа. Приблизьтесь к краям раны на коже головы и перевяжите дермальным клеем.
- Введите 0,1 мл 0,5% маркаина в края раны с помощью стерильной иглы 30 G для предотвращения местной боли, связанной с разрезом кожи головы.
- Верните животное в жилье и введите в питьевую воду послеоперационные антибиотики (0,48 мг/мл триметоприма-сульфаметоксазола или 0,5 мг/мл левофлоксацина) в течение 5 дней.
