1. Подготовка стенок тела
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка стенок тела личинок третьего возраста (для изучения NMJ, которые иннервируют мышцы стенки тела) проводилась как описано ранее, но с некоторыми изменениями.
- Вскрытие
- Выращивайте маховые потомства и кроссы при температуре 25 °C в течение пяти-шести дней, используя стандартные процедуры.
- Соберите ползающих личинок третьего возраста из флаконов или флаконов с помощью тонких щипцов.
- Вымойте личинки в небольшой чашке Петри, содержащей фосфатный буферный раствор (PBS), чтобы удалить любые частицы пищи.
- Поместите одну личинку на диск сильгарда и погрузите ее в несколько капель ледяного PBS. Использование ледяного PBS поможет оглушить личинку, облегчив манипулирование ею. На протяжении всего вскрытия следите за тем, чтобы препарат всегда был погружен в PBS, чтобы предотвратить его высыхание.
- Расположите личинку тыльной стороной вверх так, чтобы два трахейных тракта были видны под препарирующим микроскопом (Рисунок 1A). С помощью щипцов ухватитесь за мельчайший булавок, приколите личинку на заднем конце рядом с дыхальцами (Рисунок 1B). Еще одной булавкой проткните кутикулу на переднем конце возле рта крючками. Аккуратно растяните личинку вдоль, затем прижмите ее к земле (Рисунок 1B).
- С помощью ножниц для микродиссекции зажмите задний конец возле штифта, чтобы создать небольшое отверстие. Разрез должен быть достаточно поверхностным, чтобы просто проходить через кутикулу.
- Поместив кончик нижнего лезвия ножниц в разрез, разрежьте по всей длине дорсальной средней линии между двумя трахейными ходами (Рисунок 1C). При резке направляйте лезвия ножниц немного вверх, чтобы не повредить мышцы брюшной стенки тела.
- Сделайте небольшой горизонтальный разрез немного впереди расположенного сзади штифта (Рисунок 1C). Сделайте еще один подобный разрез немного позади переднего штифта (Рисунок 1C). Разрезы должны как раз проходить через кутикулу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Три разреза из этапов 1.1.7 и 1.1.8 в совокупности должны напоминать "
", когда они завершены,, т.е. , должен быть получен левый и правый лоскут на тыльной стороне тела личинки.
- Тщательно очистите внутренние органы с помощью щипцов. Добавление нескольких сильных капель PBS поможет вытеснить органы из тела личинки, тем самым облегчив их удаление. Избегайте тыкания в тело личинки, так как это приведет к повреждению мышц стенки тела.
- Раскройте тело личинки и прижмите углы вниз (Рисунок 1D). При закреплении растягивайте стенку тела как по горизонтали, так и по вертикали, чтобы сформировать равномерно натянутый прямоугольник (см. форму Рисунок 1G), стараясь при этом не порвать мышцы стенки тела.
- Завершите удаление оставшихся внутренних органов (Рисунок 1E).
- Фиксация и пермеабилизация
- Погрузите заколотые стенки тела в несколько капель Bouin's Solution. Инкубировать в течение 15 минут на льду. В качестве альтернативы можно использовать 4% параформальдегид (PFA) в качестве альтернативного фиксатора; Инкубировать в течение 30 мин.
- Трижды промойте фосфатным буферным раствором с тритоном (ПБТ).
- С помощью тонких щипцов аккуратно удалите штифты и перенесите стенки корпуса за их углы в силиконизированную микроцентрифужную пробирку объемом 0,65 мл.
- Храните стенки кузова в PBT при температуре 4 °C до готовности к PLA. Для достижения оптимальных результатов начните иммуноокрашивание стенок тела в течение дня или двух после вскрытия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы сэкономить на реагентах и гарантировать, что все стенки тела обрабатываются одинаково во время анализа, различные генотипы могут быть помещены в одну пробирку. Генотипы можно различить, срезая углы стенок тела по-разному (см., например, Рисунок 1F).
2. Иммуногистохимия
ПРИМЕЧАНИЕ: Иммуноокрашивание стенок тела личинок третьего возраста проводили, как описано ранее, но с некоторыми изменениями.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все шаги при комнатной температуре и с легким перемешиванием, если не указано иное.
- Блокировка
- Вымыть стенки кузова ПБТ трижды по 10 мин каждый.
- Добавьте 1% альбумин бычьей сыворотки (BSA) на 1 час
- Иммуноокрашивание
- Инкубируйте стенки тела первичными антителами мыши и кролика против двух представляющих интерес белков (разбавленных в 1% BSA) в течение 2 часов при комнатной температуре или в течение ночи при 4 °C. В этом случае используйте мышиный анти-Dlg 1:10 (Dlg = большие диски) и 1:250 кролик анти-HtsM (HtsM: Hu-li tai shao mutant). Антитела против маркеров, которые не вырабатываются мышами или кроликами, также могут быть включены — e., использовать козий анти-Hrp в соотношении 1:200 (Hrp = пероксидаза хрена) для разграничения мембран нейронов.
- Промыть с PBT три раза по 10 мин каждый.
- Инкубируют с флуорконъюгированными вторичными антителами для обнаружения маркеров (разбавленных в 1% БСА) в течение 2 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 °С. Поскольку сигнал PLA позже визуализируется с помощью красного флуорофора, для обнаружения маркера необходимо использовать другой флуорофор — e.g., использовать 1:200 флуоресцеин изотиоцианат (FITC)-конъюгированный анти-козий антитело козы для обнаружения козьего антитела против HRP. Из-за использования светочувствительных реагентов с этого момента пробирки следует держать в темноте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используемый набор позволяет проводить ОЛА между первичными антителами, выращенными у мыши и кролика, с визуализацией сигнала на красном канале при конфокальной микроскопии. При желании доступны другие наборы, которые позволяют проводить анализ с первичными антителами, поднятыми у других видов, и визуализировать сигнал по другим каналам.
3. Анализ близости-лигирования
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все шаги при комнатной температуре и с легким перемешиванием, если не указано иное.
- Зонды PLA
- Вымыть стенки кузова ПБТ трижды по 10 мин каждый.
- Инкубировать с помощью зондов PLA (разведение 1:5 каждый в 1% BSA) в течение 2 часов при 37 °C. В этом случае используйте 40 μл PLA зонда anti-mouse MINUS, 40 μл PLA зонда anti-rabbit PLUS и 120 μл 1% BSA для обеспечения правильного погружения и перемешивания 5-10 стенок тела. Разведение зондов PLA с соотношением до 1:25 все еще может привести к адекватному соотношению сигнал/шум (т.е., для этого эксперимента).
- Лигатура
- Промойте стенки тела с помощью Wash Buffer A дважды по 5 минут каждый.
- Инкубировать с раствором лигирования (1:40 разведение лигазы в буфере для лигирования) в течение 1 часа при 37 °C. В этом случае используйте 5 μл Лигазы, 40 μл 5 Лигионного буфера и 155 μл воды высокой чистоты, чтобы обеспечить правильное погружение и перемешивание 5-10 стенок тела.
- Усиление
- Промойте стенки кузова с помощью Wash Buffer A дважды по 2 минуты каждый.
- Инкубировать с раствором амплификации (1:80 разведение полимеразы в буфере для амплификации) в течение 2 ч при 37 °C. В этом случае используйте 2,5 мкл полимеразы, 40 мкл 5 амплификационного буфера и 157,5 мкл воды высокой чистоты, чтобы обеспечить правильное погружение и перемешивание 5-10 стенок корпуса.
- Подготовка к визуализации
- Промойте стенки кузова с помощью буфера для мытья B дважды по 10 минут каждый.
- Постирайте с 0,01x буфером для стирки B один раз в течение 1 мин.
- Уравновесьте в нескольких каплях монтажного раствора не менее 30 минут перед монтажом или храните в течение ночи при температуре 4 °C.
- С помощью тонких щипцов аккуратно перенесите стенки тела на горку платформы кутикулой вниз. Расположите стенки корпуса рядами и в одинаковой ориентации в пределах одного-двух капель от монтанта. Наденьте на препарат покровное стекло размером 22 мм x 40 мм, стараясь не допустить образования пузырьков воздуха, затем запечатайте предметное стекло прозрачным лаком для ногтей.
- Храните предметные стекла в темноте при температуре -20 °C до тех пор, пока они не будут готовы к конфокальной визуализации.
