Обнаружение белок-белковых взаимодействий у личинок дрозофил с помощью анализа близости-лигирования

Аннотация

Источник: Wang, S., et al. Обнаружение белково-белковых комплексов in situ в нервно-мышечном соединении личинок дрозофилы с помощью анализа близости. J. Vis. Exp. (2015).

Это видео демонстрирует визуализацию белок-белковых взаимодействий в нервно-мышечном переходе дрозофилы (NMJ) с использованием анализа близости-лигирования (PLA). После выделения стенок организма взаимодействующие белки зондируются первичными антителами и PLA-конъюгированными вторичными антителами. Близость взаимодействующих белков облегчает лигирование зондов с коннекторными олигонуклеотидами, образуя кольцевую ДНК, которая затем амплифицируется путем амплификации по вращающемуся кругу. Флуоресцентные зонды связываются с амплифицированной ДНК, что позволяет визуализировать белок-белковые взаимодействия в NMJ.

Протокол

1. Подготовка стенок тела

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка стенок тела личинок третьего возраста (для изучения NMJ, которые иннервируют мышцы стенки тела) проводилась как описано ранее, но с некоторыми изменениями.

1. Вскрытие
   1. Выращивайте маховые потомства и кроссы при температуре 25 °C в течение пяти-шести дней, используя стандартные процедуры.
   2. Соберите ползающих личинок третьего возраста из флаконов или флаконов с помощью тонких щипцов.
   3. Вымойте личинки в небольшой чашке Петри, содержащей фосфатный буферный раствор (PBS), чтобы удалить любые частицы пищи.
   4. Поместите одну личинку на диск сильгарда и погрузите ее в несколько капель ледяного PBS. Использование ледяного PBS поможет оглушить личинку, облегчив манипулирование ею. На протяжении всего вскрытия следите за тем, чтобы препарат всегда был погружен в PBS, чтобы предотвратить его высыхание.
   5. Расположите личинку тыльной стороной вверх так, чтобы два трахейных тракта были видны под препарирующим микроскопом (Рисунок 1A). С помощью щипцов ухватитесь за мельчайший булавок, приколите личинку на заднем конце рядом с дыхальцами (Рисунок 1B). Еще одной булавкой проткните кутикулу на переднем конце возле рта крючками. Аккуратно растяните личинку вдоль, затем прижмите ее к земле (Рисунок 1B).
   6. С помощью ножниц для микродиссекции зажмите задний конец возле штифта, чтобы создать небольшое отверстие. Разрез должен быть достаточно поверхностным, чтобы просто проходить через кутикулу.
   7. Поместив кончик нижнего лезвия ножниц в разрез, разрежьте по всей длине дорсальной средней линии между двумя трахейными ходами (Рисунок 1C). При резке направляйте лезвия ножниц немного вверх, чтобы не повредить мышцы брюшной стенки тела.
   8. Сделайте небольшой горизонтальный разрез немного впереди расположенного сзади штифта (Рисунок 1C). Сделайте еще один подобный разрез немного позади переднего штифта (Рисунок 1C). Разрезы должны как раз проходить через кутикулу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Три разреза из этапов 1.1.7 и 1.1.8 в совокупности должны напоминать "", когда они завершены,, т.е. , должен быть получен левый и правый лоскут на тыльной стороне тела личинки.
   9. Тщательно очистите внутренние органы с помощью щипцов. Добавление нескольких сильных капель PBS поможет вытеснить органы из тела личинки, тем самым облегчив их удаление. Избегайте тыкания в тело личинки, так как это приведет к повреждению мышц стенки тела.
   10. Раскройте тело личинки и прижмите углы вниз (Рисунок 1D). При закреплении растягивайте стенку тела как по горизонтали, так и по вертикали, чтобы сформировать равномерно натянутый прямоугольник (см. форму Рисунок 1G), стараясь при этом не порвать мышцы стенки тела.
   11. Завершите удаление оставшихся внутренних органов (Рисунок 1E).
2. Фиксация и пермеабилизация
   1. Погрузите заколотые стенки тела в несколько капель Bouin's Solution. Инкубировать в течение 15 минут на льду. В качестве альтернативы можно использовать 4% параформальдегид (PFA) в качестве альтернативного фиксатора; Инкубировать в течение 30 мин.
   2. Трижды промойте фосфатным буферным раствором с тритоном (ПБТ).
   3. С помощью тонких щипцов аккуратно удалите штифты и перенесите стенки корпуса за их углы в силиконизированную микроцентрифужную пробирку объемом 0,65 мл.
   4. Храните стенки кузова в PBT при температуре 4 °C до готовности к PLA. Для достижения оптимальных результатов начните иммуноокрашивание стенок тела в течение дня или двух после вскрытия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы сэкономить на реагентах и гарантировать, что все стенки тела обрабатываются одинаково во время анализа, различные генотипы могут быть помещены в одну пробирку. Генотипы можно различить, срезая углы стенок тела по-разному (см., например, Рисунок 1F).

2. Иммуногистохимия

ПРИМЕЧАНИЕ: Иммуноокрашивание стенок тела личинок третьего возраста проводили, как описано ранее, но с некоторыми изменениями.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все шаги при комнатной температуре и с легким перемешиванием, если не указано иное.

1. Блокировка
   1. Вымыть стенки кузова ПБТ трижды по 10 мин каждый.
   2. Добавьте 1% альбумин бычьей сыворотки (BSA) на 1 час
2. Иммуноокрашивание
   1. Инкубируйте стенки тела первичными антителами мыши и кролика против двух представляющих интерес белков (разбавленных в 1% BSA) в течение 2 часов при комнатной температуре или в течение ночи при 4 °C. В этом случае используйте мышиный анти-Dlg 1:10 (Dlg = большие диски) и 1:250 кролик анти-HtsM (HtsM: Hu-li tai shao mutant). Антитела против маркеров, которые не вырабатываются мышами или кроликами, также могут быть включены — e., использовать козий анти-Hrp в соотношении 1:200 (Hrp = пероксидаза хрена) для разграничения мембран нейронов.
   2. Промыть с PBT три раза по 10 мин каждый.
   3. Инкубируют с флуорконъюгированными вторичными антителами для обнаружения маркеров (разбавленных в 1% БСА) в течение 2 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 °С. Поскольку сигнал PLA позже визуализируется с помощью красного флуорофора, для обнаружения маркера необходимо использовать другой флуорофор — e.g., использовать 1:200 флуоресцеин изотиоцианат (FITC)-конъюгированный анти-козий антитело козы для обнаружения козьего антитела против HRP. Из-за использования светочувствительных реагентов с этого момента пробирки следует держать в темноте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используемый набор позволяет проводить ОЛА между первичными антителами, выращенными у мыши и кролика, с визуализацией сигнала на красном канале при конфокальной микроскопии. При желании доступны другие наборы, которые позволяют проводить анализ с первичными антителами, поднятыми у других видов, и визуализировать сигнал по другим каналам.

3. Анализ близости-лигирования

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все шаги при комнатной температуре и с легким перемешиванием, если не указано иное.

1. Зонды PLA
   1. Вымыть стенки кузова ПБТ трижды по 10 мин каждый.
   2. Инкубировать с помощью зондов PLA (разведение 1:5 каждый в 1% BSA) в течение 2 часов при 37 °C. В этом случае используйте 40 μл PLA зонда anti-mouse MINUS, 40 μл PLA зонда anti-rabbit PLUS и 120 μл 1% BSA для обеспечения правильного погружения и перемешивания 5-10 стенок тела. Разведение зондов PLA с соотношением до 1:25 все еще может привести к адекватному соотношению сигнал/шум (т.е., для этого эксперимента).
2. Лигатура
   1. Промойте стенки тела с помощью Wash Buffer A дважды по 5 минут каждый.
   2. Инкубировать с раствором лигирования (1:40 разведение лигазы в буфере для лигирования) в течение 1 часа при 37 °C. В этом случае используйте 5 μл Лигазы, 40 μл 5 Лигионного буфера и 155 μл воды высокой чистоты, чтобы обеспечить правильное погружение и перемешивание 5-10 стенок тела.
3. Усиление
   1. Промойте стенки кузова с помощью Wash Buffer A дважды по 2 минуты каждый.
   2. Инкубировать с раствором амплификации (1:80 разведение полимеразы в буфере для амплификации) в течение 2 ч при 37 °C. В этом случае используйте 2,5 мкл полимеразы, 40 мкл 5 амплификационного буфера и 157,5 мкл воды высокой чистоты, чтобы обеспечить правильное погружение и перемешивание 5-10 стенок корпуса.
4. Подготовка к визуализации
   1. Промойте стенки кузова с помощью буфера для мытья B дважды по 10 минут каждый.
   2. Постирайте с 0,01x буфером для стирки B один раз в течение 1 мин.
   3. Уравновесьте в нескольких каплях монтажного раствора не менее 30 минут перед монтажом или храните в течение ночи при температуре 4 °C.
   4. С помощью тонких щипцов аккуратно перенесите стенки тела на горку платформы кутикулой вниз. Расположите стенки корпуса рядами и в одинаковой ориентации в пределах одного-двух капель от монтанта. Наденьте на препарат покровное стекло размером 22 мм x 40 мм, стараясь не допустить образования пузырьков воздуха, затем запечатайте предметное стекло прозрачным лаком для ногтей.
   5. Храните предметные стекла в темноте при температуре -20 °C до тех пор, пока они не будут готовы к конфокальной визуализации.

Результаты

Рисунок 1: Подготовка стенок тела личинки третьего возраста. (А-Ж) Схематические рисунки, изображающие вскрытие стенки тела. (A) Поместите одну личинку на сильгардный диск тыльной стороной вверх так, чтобы были видны два трахейных тракта. (B) Приколите личинку на переднем и заднем концах мельчайшими булавками, При этом личинка растягивается вдоль. (C)

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Щипцы (fine #5)	Алмедик	А10-704
Sylgard Disc	Мировые прецизионные приборы	SYLG184	Смешайте эластомерную основу и отвердитель в соотношении 10:1. Заставьте на 30 мин. Перелейте в форму (например, используйте 12-луночный планшет для культивирования клеток). Дайте застыть не менее 24 часов. При вскрытии приклеивайте к крышке чашки Петри размером 60x15 мм.
Штифты Minutien (диаметр наконечника 0,0125 мм)	Инструменты изобразительной науки	26002-10
Ножницы для микродиссекции (ультратонкие)	Инструменты изобразительной науки	15200-00
Горки с платформой			Приклейте два покровных стекла размером 22x22 мм на предметное стекло микроскопа прозрачным лаком для ногтей, оставив зазор <20 мм между ними для установки образца.
w1118	Блумингтонский фондовый центр дрозофилы	3605
hts01103	Фондовый центр дрозофил в Блумингтоне	10989	Приклад был перебалансирован по балансировщику GFP, чтобы гомозиготные мутанты могли быть выбраны на основе отсутствия сигнала GFP.
1x PBS (фосфатно-солевой буфер): 3mM NaH2PO4, 7mM Na2HPO4, 130mM NaCl, pH 7.0			NaH2PO4 (Caledon Laboratories - 8180-1), Na2HPO4 (Caledon - 8120-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
Решение Буэна	Сигма-Олдрич	HT10132
4% PFA (параформальдегид): 4% PFA в 1x PBS			ПФА (наука об анахемии - 66194-300). Смотрите doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 для получения инструкций о том, как сделать решение.
1x PBT (фосфатно-солевой буфер с тритоном): 1x PBS с 0,01% тритона			Triton X-100 (Sigma-Aldrich - T8787)
1% BSA (бычий сывороточный альбумин): 1% BSA в 1x PBT			BSA (Bioshop Canada - ALB001). Хранить при температуре 4 °C.
мышь анти-Dlg (Диски большие)	Исследования развития Hybridoma Bank	4F3	Используйте в соотношении 1:10 в 1% BSA.
кролик анти-ХтсМ (Ху-ли тай шао)			Предоставлено доктором Линн Кули (Йельский университет). Используйте в разведении 1:250 в 1% BSA.
Кроличий анти-Пак (p21-активированная киназа)			Предоставлено доктором Николасом Харденом (Университет Саймона Фрейзера). Используйте в разведении 1:500 в 1% BSA.
мышь анти-Wg (Бескрылый)	Исследования развития Hybridoma Bank	4D4	Используйте в соотношении 1:5 в 1% BSA.
козий анти-Hrp (пероксидаза хрена)	Джексон ИммуноResearch	123-065-021	Используйте в разведении 1:200 в 1% BSA.
FITC-конъюгированный ослик против козы	Джексон ИммуноResearch	705-095-003	Используйте в разведении 1:200 в 1% BSA.
Датчик Duolink In Situ PLA против мыши MINUS	Сигма-Олдрич	DUO92004
Duolink In Situ PLA Probe anti-rabbit PLUS	Сигма-Олдрич	DUO92002
Реагенты для обнаружения in situ Duolink Red	Сигма-Олдрич	DUO92008
1x Буфер промывки A: 0,01M Tris, 0,15M NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,4	Сигма-Олдрич	DUO82049	Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific - BP337)
1x Буфер промывки B: 0,2M Tris, 0,1M NaCl, pH 7,5	Сигма-Олдрич	DUO82049	Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
0,01x Буфер для промывки B: 2 мМ Tris, 1 мМ NaCl, pH 7,5	Сигма-Олдрич	DUO82049	Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
Монтажная среда Duolink in situ с DAPI	Сигма-Олдрич	DUO82040