Методическая статья

Определение способности изолированных митохондрий удерживать кальций

8 июля 2025 г.

В этой статье

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Li, W., et. al. Анализ ретенционной способности митохондрий Ca2+ и анализ митохондриального отека, вызванный Ca2+. J. vis. exp. (2018)

В этом видео показана процедура оценки способности митохондрий к удержанию кальция путем мониторинга изменений флуоресценции в режиме реального времени по мере поглощения кальция митохондриями. Этот анализ полезен для изучения функции митохондрий и процессов, связанных с кальцием, включая апоптоз и нейродегенеративные заболевания.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Определение емкости митохондриального Ca2+

  1. Приготовьте среду KCl (125 мМ KCl (хлорид калия), 2 мМ K2HPO4 (дикалийфосфат), 1 мМ MgCl2 (хлорид магния), 20 мМ ГЕПЕС (2-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]этансульфоновая кислота), 5 мМ глутамата, 5 мМ малата и 2 мкМ ротенона, pH 7,4) и добавьте связывающий Ca2+ зеленый флуоресцентный краситель до конечной концентрации 0,5 мкМ перед экспериментом.
  2. Перенесите 1 мл изолированных митохондрий (0,4 мг/мл) в среду KCl, содержащую 0,5 мкМ Ca2+-связывающий зеленый флуоресцентный краситель, в каждую 6-лунку планшета.
  3. Инкубируйте митохондрии и связывающий Ca2+-связывающий зеленый флуоресцентный краситель в 6-луночном планшете при комнатной температуре, в защищенном от внешнего света в течение 1 минуты. Добавьте 4 мкл аликвот 20 мМ раствора CaCl2 (хлорид кальция) (20 мМ CaCl2, 127 мМ KCl, 1 мМ MgCl2, 20 мМ HEPES, 5 мМ глутамата, 5 мМ малата, pH 7,4) в каждую 6-луночную скважину, используя автоматическую настройку дозирования для введения 200 нмоль Ca2+/мг митохондриального белка.
  4. Используйте флуоресцентный спектрометр для контроля изменений флуоресценции каждые 3 с в течение 2 мин с длиной волны возбуждения 506 нм и длиной волны излучения 531 нм. Пластина оснащена встряхиванием при 600 об/мин в течение 3 с между показаниями, контролируемыми программным обеспечением (Рисунок 1).
  5. Добавьте в каждую лунку дополнительную аликвоту 4 мкл 20 мМ раствора CaCl2 и контролируйте изменения флуоресценции каждые 3 с в течение 2 минут. Повторяйте этот шаг до тех пор, пока флуоресценция со временем не увеличится.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Митохондрии подвергаются воздействию добавленного Ca2+, на что указывает повышенная флуоресценция записи. Когда mPTP (переходная пора митохондриальной проницаемости) открывается, флуоресценция со временем увеличивается.
  6. Интерпретируйте общее количество добавленных Ca2+ до тех пор, пока mPTP не откроется как емкость хранения Ca2+.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Рисунок 1: Программные настройки для анализа емкости ретенции митохондриального Ca2+.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Конфликт интересов не декларируется.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Кальций зеленый-5NТехнологии жизниc-3737Связывающий кальций зеленый флуоресцентный краситель
ГлутаматСигма-ОлдричRES5063G-A7
МалатеСигма-Олдрич46940-U
RotenoneСигма-ОлдричР8875
ХЕПЕССигма-ОлдричH3375
Хлорид магнияСигма-Олдрич457
ДикалийфосфатСигма-ОлдричV900050
KClСигма-ОлдричP9541
Хлорид кальцияСигма-ОлдричV900266

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи