$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры с участием животных были рассмотрены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.
1. Подготовка инфузионных систем с микроосмотическим насосом
ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте насос, буфер для искусственной спинномозговой жидкости (aCSF) и лекарство (раствор белка Met-CCL5/RANTES (10 нг/мл в aCSF)) в стерильных условиях, используя буферы, отфильтрованные фильтрами 0,2 мкм, и проводите все процедуры под капюшоном для культуры в перчатках. Хирургические процедуры проводятся следующим образом:
- Подготовьте микроосмотические насосы за день до операции: Наполните микроосмотический насос головного мозга искусственной спинномозговой жидкостью (aCSF) с помощью шприца объемом 1 мл и иглы с тупой головкой, которые входят в комплект. Погрузите микроосмотический насос в aCSF и поместите его на шейкер с легким встряхиванием на ночь.
ВНИМАНИЕ: Насос должен быть заполнен аCSF, и внутри насоса не должно быть пузырьков воздуха (Рисунок 1A).
- Перед началом операции приготовьте для эксперимента раствор рекомбинантного белка Met-CCL5/RANTES (10 нг/мл, разведенный в аКСФ). Удалите aCSF из насоса и медленно заполните насос раствором препарата, пока излишки не вытекут.
ПРИМЕЧАНИЕ: 15 мл раствора aCSF или Met-CCL5/RANTES достаточно для 5-8 насосов.
ВНИМАНИЕ: Повторите процедуру, чтобы убедиться, что помпа полностью заполнена препаратом без пузырьков внутри.
- Разрежьте трубки катетера нужной длины и прикрепите их к тупой игле для инфузии мозга в наборе для инфузии мозга. Наполните препаратом инфузионный набор и пробирки.
- Наконец, соберите и прикрепите набор для инфузии мозга к микроосмотическому насосу.
ВНИМАНИЕ: В трубке или насосе не должно образовываться пузырьков (Рисунок 1A).
- Погрузите весь набор осмотического насоса и мозга в aCSF в стерилизованную пробирку объемом 50 мл, чтобы предотвратить высыхание насоса. Набор для осмотического сращения насоса и мозга теперь готов к использованию в хирургии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Микроосмотические насосные системы можно использовать для длительной инфузии лекарственных препаратов. Это обеспечивает безопасный и удобный режим доставки лекарств в мозг мыши.
2. Внутримозговая желудочковая хирургия – имплантация микроосмотического насоса
ВНИМАНИЕ: Стерилизуйте хирургическую среду с помощью 75% этанола и убедитесь, что люди, участвующие в исследовании, носят стерильные перчатки и чистый лабораторный халат. Хирургические инструменты/инструменты должны быть автоклавированы и высушены перед использованием, а затем стерилизованы 75% этанолом в перерывах между операциями на мышах.
- Взвесьте мышь и обезболите ее с помощью внутрибрюшинной инъекции (ВП) с кетамином/ксилазином (кетамин 50 мг/кг, ксилазин 10 мг/кг).
ВНИМАНИЕ: Мышам с массой тела менее 24 г не рекомендуется проводить операцию по имплантации осмотической помпы.
- Установите и закрепите головку мыши на стереотаксическом аппарате (рис. 1B).
- С помощью хирургических ножниц и клещей разрежьте внешнюю кожу, покрывающую череп. Используйте йод для очистки периферического черепа.
- Отделите внешний слой кожи от подкожной кожи с помощью пары клещей с тупой головкой в области шеи для имплантации осмотического насоса и мозгового комплекса (рис. 1C).
- Отметьте точку инфузии относительно карты мозга (рисунок 1D) с помощью стереотаксического аппарата. В этом эксперименте игла должна быть имплантирована в область3-го желудочка (Bregma: 0,0 мм латерально, 1,3 мм сзади, 5,7 мм вентрально).
- Просверлите отверстие с помощью сверла для гвоздей вокруг области, отмеченной на черепе (Рисунок 1E).
ВНИМАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не повредить мозговые оболочки и кровеносные сосуды мыши, тем самым избегая разрушения микрокровеносных сосудов в мозге.
- Поместите микроосмотический набор для синтеза насоса и мозга, содержащий aCSF (в качестве контроля) или лекарственный препарат (раствор белка Met-CCL5/RANTES) под кожу за областью шеи и вставьте иглу для инфузии мозга в просверленное отверстие, чтобы ввести препарат в мозг мыши (рис. 1E). Игла проникнет в мозговые оболочки и попадет в желудочек. Закрепите иглу на месте на черепе с помощью поверхностного десенсибилизирующего геля (Рисунок 1F) и подождите 1-2 минуты, пока клей высохнет. Далее отрежьте выступающую часть сверху иглы (рисунок 1G-H).
- Используйте тканевый клеевой клей для заживления операционной раны на голове. Нанесите 50 мкл клея поверх раны, стяните обе стороны кожи вместе и удерживайте в течение 30 секунд, чтобы кожа запечаталась (рис. 1I).
ВНИМАНИЕ: Используйте 100% спиртовую салфетку для очистки раны после операции и 100 мкл пенициллина со стрептомицином для предотвращения инфекции. заметка: Кожа мыши образует рубцовую ткань и заживает через несколько дней после введения хирургического клея. Основным преимуществом клея является отсутствие хирургических швов, которые могут вызвать раздражение или воспаление кожи.
- Поместите мышь в чистую клетку на теплой тарелке (нагретой до 37 °C) и подождите><, пока мышь оправится от обезболивающего эффекта.
ВНИМАНИЕ: Крайне важно поддерживать температуру тела мыши, чтобы повысить шансы на выживание после операции.
- После недельного периода восстановления мыши будут готовы к дальнейшим экспериментам, таким как пероральный тест на толерантность к глюкозе (OGTT) и тест на толерантность к инсулину (ITT).
3. Пероральный тест на толерантность к глюкозе (ПГТТ)
ПРИМЕЧАНИЕ: Проведите пероральный тест на толерантность к глюкозе через 7 дней после инфузии aCSF и MetCCL5/RANTES (10 нг/мл, 100 μл). Поддерживайте 6-часовое голодание для мышей перед ПГТТ с достаточным запасом воды. Держите животных на том же рабочем столе, где будут проводиться эксперименты, чтобы они могли акклиматизироваться к окружающей среде и снизить стресс во время процедуры.
- Приготовление раствора глюкозы: Перед проведением эксперимента приготовьте раствор глюкозы, растворив 3,75 г глюкозы в 15 мл дистиллированногоН2О.
- Составьте график записи показаний во время экспериментальной процедуры (Таблица 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно составить график с правильными интервалами между каждым исследованием крови, чтобы обеспечить точную регистрацию во время эксперимента.
- Взвесьте каждую мышь после голодания и рассчитайте соответствующее количество глюкозы, которое необходимо ввести. Например, если мышь весит 30 г, количество вводимого раствора глюкозы должно составлять 300 мкл.
- Подготовьте на верстаке следующие инструменты:
- Глюкометр (Нажмите кнопку запуска, чтобы проверить состояние батареи; убедитесь, что она функционирует перед проверкой.)
- Глюкозный чип
- Инсулиновый шприц (0,3 мл инсулинового шприца)
- Лезвия
- таймер
- После того, как стенд будет установлен, измерьте и запишите уровень глюкозы в крови следующим образом: Вставьте чистый и новый чип глюкозы в глюкометр и нажмите кнопку запуска, чтобы обнулить его.
- Возьмите мышь за заднюю часть шеи и несколько раз погладьте хвост, чтобы обеспечить достаточный приток крови к области хвоста.
- С помощью нового лезвия бритвы отрезать небольшой кусочек хвоста и выдавить одну маленькую каплю крови (около 10-20 мкл) в глюкозный чип. Кровь должна заполнить чип, чтобы обеспечить точное измерение. Глюкометр сразу же отобразит уровень глюкозы. Если аппарат показывает «ошибку», повторите процедуру с новым глюкозным чипом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для чипа с глюкозой требуется всего одна капля крови. Если образец крови необходимо собрать более одного раза, просто надавите, проведя пальцами по хвосту мыши несколько раз, удерживая конец хвоста прямо на вершине чипа, чтобы собрать кровь. Не стоит каждый раз обрезать хвостовую часть во время сбора образцов крови.
- Затем накормите мышей глюкозой (0,25 г/мл) перорально, используя технику внутрижелудочного зондирования. Количество вводимой глюкозы следует рассчитывать по формуле: 10-кратная масса тела (МТ) мкл раствора глюкозы (например, если мышь весит 30 г, количество вводимого раствора глюкозы составит 300 мкл). Запустите таймер сразу после перорального введения глюкозы.
- Повторите процедуру измерения уровня глюкозы через 15, 30, 60, 90 и 120 минут.
- После того, как все показания уровня глюкозы будут зафиксированы, выбросьте бритвенные лезвия и чипсы с глюкозой в контейнер для биологически опасных веществ. Положите еду обратно в клетки для мышей и верните их в помещение для животных.
Таблица 1. График записи перорального теста на толерантность к глюкозе (ПГТТ)
| # | Идентификатор мыши | тело | глюкоза | начало | 0 | 15 | 30 | 60 | 90 |
| | вес | μL =10xBW | Время | Минут | Минут | Минут | Минут | Минут |
| 1 | 501 | 25,8 г | 258 | 9:00 | 9:00 | 9:00 | 9:15 | 9:30 | 10:00 |
| 2 | 502 | 25.3г | 253 | 9:07 | 9:07 | 9:07 | 9:22 | 9:37 | 10:07 |
