Экспериментальная индукция глаукомы через обструкцию иридокорнеального угла на мышиной модели

Аннотация

Источник: Bunker, S., et al. Экспериментальная глаукома, индуцированная глазной инъекцией магнитных микросфер. J. Vis. Exp. (2015)

В этом видео крыса под наркозом проходит офтальмологическую процедуру, во время которой магнитные шарики вводятся в переднюю камеру под действием магнитного поля, чтобы блокировать иридокорнеальный угол. Эта закупорка препятствует трабекулярной сети, препятствуя дренажу водянистой влаги и приводя к повышению внутриглазного давления, повреждая ганглиозные клетки сетчатки и зрительный нерв. При этом развивается состояние, подобное глаукоме.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Индукция глазной гипертензии

1. Вызвать экспериментальную глаукому путем повышения внутриглазного давления (ВГД) путем односторонней инъекции парамагнитных микросфер в переднюю камеру коричневых норвежских крыс. Другие пигментированные крысы могут подойти, хотя пользователю нужно будет сначала проверить их.
2. Содержание 250-300 г самки экс-заводчика бурой норвежской крысы в условиях постоянной низкой освещенности (40-60 люкс) для минимизации суточных колебаний ВГД, с доступом к пище и воде.
3. Проведите исходные измерения ВГД у бодрствующих животных8 перед анестезией и введением шариков с помощью тонометра отскока, откалиброванного для использования на глазу крысы9. ВГД принимается как среднее арифметическое пяти показаний.
4. Анестезируйте крыс 37,5 мг/кг кетамином и 0,25 мг/кг медетомидина гидрохлорида, вводимыми внутрибрюшинно. Подтвердите глубину анестезии, проверив рефлексы задней части стопы животного перед введением повидон-йода (см. шаг 1.5) и инъекцией шариков (см. шаг 1.8). Введите 0,5% пропаракаина гидрохлорид для обезболивания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не расширяйте зрачок ни на каком этапе. Это поможет бусинам лучше прижиться в радужно-корнеальном угле и предотвратит залипание с линзой. Нанесите глазную мазь для предотвращения высыхания роговицы на неоперированном контралатеральном глазу.
5. Промыть операционный глаз 5% повидон-йодом в воде за 5 минут до инъекции.
6. Через 5 минут смыть повидон-йод с помощью стерильной марли и промыть глаз 0,9% стерильным физиологическим раствором. Поддерживайте влажный глаз во время анестезии с регулярным применением стерильного физиологического раствора.
7. Поместите тороидальный магнит вокруг глаза.
8. Введите 25 мкл раствора, содержащего 30 мг/мл гамма-облученных стерилизованных магнитных микросфер размером 8 мкм в сбалансированном солевом растворе Хэнка (HBSS), в переднюю камеру с помощью иглы со скошенной углом 33 G.
   1. Для приготовления шариков промойте путем повторного суспензирования, а затем центрифугируйте 3 раза при 10 000 x g в течение 5 минут с 1 мл HBSS перед получением окончательного раствора 30 мг/мл. Поддерживайте стерильные условия на протяжении всего времени.
   2. При инъекции будьте осторожны, избегайте введения иглы в радужную оболочку, чтобы свести к минимуму риск травмы радужной оболочки. Этого можно избежать, если ориентировать иглу по касательной к поверхности роговицы, как можно более параллельно радужной оболочке. Это также поможет свести к минимуму потерю гранул из места инъекции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вводите шарики в быстром темпе, чтобы обеспечить равномерное распределение вокруг иридорогового угла, что имеет решающее значение для повышения ВГД. Кроме того, храните бусины, иглы и магнитные кольца отдельно, чтобы бусины не образовывали кластеры, затрудняющие их загрузку в шприц и инъекции, а также чтобы игла не намагничивалась.
9. Оставьте иглу на месте на 1 минуту после инъекции, чтобы убедиться, что шарики оседают в радужно-роговом угле, препятствуя оттоку воды из трабекулярной сетки. Слегка наклоните иглу после того, как шарики первоначально осядут, чтобы допустить некоторую утечку воды, чтобы свести к минимуму временное увеличение ВГД. В конце операции промывайте иглу сначала фосфатно-солевым буфером (PBS), затем 70% этанолом, а затем дистиллированной водой, чтобы обеспечить непрерывное использование иглы в отдельных процедурах. В качестве альтернативы можно использовать одноразовые иглы, если доступна правильная комбинация калибра и шприца. Дополнительно: иглы можно затачивать с помощью фаски, чтобы продлить срок их использования.
10. На этом этапе, при необходимости, снимите магнит, и используйте его для втягивания бусин в участки неполного покрытия.
11. Оставьте магнит на месте вокруг глаза еще на 10 минут после инъекции, чтобы шарики хорошо прилегли к радужному углу.
12. Обратная анестезия с использованием 0,25 мг/кг атипемезола гидрохлорида.
13. Вводите хлорамфеникол или другую антибиотическую мазь, например, гентамицин или террамицин местно для предотвращения инфекции, и 0,5% пропаракаина гидрохлорид для обезболивания. Оставьте животных восстанавливаться на тепловом коврике до тех пор, пока они не восстановятся в движении, затем переложите их в теплую коробку и обеспечьте их дополнительным питанием, таким как пищевая добавка или увлажненный обычный рацион, до полного восстановления. Системную или местную анальгезию следует проводить животным с признаками боли через 24 часа после операции. Если эти симптомы сохраняются, несмотря на лечение, животных следует гуманно отбраковывать.
14. Используйте контралатеральный глаз в качестве неоперируемого контроля.
15. Измеряйте ВГД каждые 2-3 дня после введения шариков и каждые 2-3 дня после этого с помощью тонометра отбоя, откалиброванного для использования в глазах крыс.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
250-300г самки коричневых норвежских экс-заводчиков крыс	Харлан Великобритания	203
Тонометр отскока	Tiolat	ТВ02
Кетазет (кетамин)	Форт Додж Здоровье животных	BN1000118	37,5 мг/кг
Домитор (медетомидина гидрохлорид)	Орион Фарма	140-999	0,25 мг/кг
Повидон йод	Эколаб	BN4369LE10	5% в H2O
Солевой раствор Минима	Бауш и Ломб	PL00033/5017
Тороидальный магнит	Супермагнит	Р-10-07-03-Н
Магнитные микросферы	Лаборатории Бэнгса	UMC4N/9692
HBSS	Invitrogen	14025
33-калибровая скошенная игла	Гамильтон	7747-01	Пользовательская игла
Шприц с наконечником Люэра	Гамильтон	80601
Антиседан (атипемезола гидрохлорид)	Орион Фарма	141-003	0,25 мг/кг
Мазь с хлорамфениколом	Медиком	18956-0005