$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.
1. Подготовка предметных стекол и тканей
- Используйте либо предметные стекла из силана-подготовки, либо стеклянные стекла из полиэтиленового нафталата (PEN).
- Для выделения РНК окуните предметные стекла в раствор для обеззараживания РНКазы, промойте 3 раза водой, не содержащей РНКазы, затем обезвожьте с помощью градуированной серии этанола, не содержащего РНКазы, и высушите в вакууме в течение 30 минут.
- Разрежьте срезы ткани толщиной 10 мкм с помощью криостата и установите на подготовленные стекол, свободные от РНКазы. Держите срезы замороженными во время среза, чтобы сохранить качество РНК. ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что ткань находится примерно в 4 мм от краев предметного стекла, так как LCM не может удалить ткань, которая находится слишком близко к краям предметного стекла. Чтобы удалить ткань со предметного стекла PEN-мембраны, убедитесь, что ткань находится на расстоянии 4 мм от левой, верхней и нижней сторон и 7 мм от правой стороны предметного стекла, что соответствует размерам мембраны, которая не прикреплена к предметному стеклу.
- Для выделения отдельных клеточных популяций с помощью прямой иммуногистохимии срежьте ткань либо на предметные стекла Silane-prep, либо на предметные стекла мембраны PEN. Для выделения участков ткани с использованием методов непрямой иммуногистохимии установите один набор срезов на предметное стекло Silane-prep для иммуногистохимии, а чередуйте срезы либо на предметном стекле мембраны PEN, либо на предметном стекле Silane-prep для использования для LCM.
2. Подготовка тканей к лазерному захвату – быстрая иммуногистохимия тирозингидроксилазы для прямого лазерного захвата иммунореактивных клеток
- Обведите ткань гидрофобной ручкой и дайте высохнуть.
- Зафиксировать ткань в растворе ацетон-метанол (1:1) при -20 °C в течение 10 мин. ПРИМЕЧАНИЕ: Наш опыт показал, что фиксация ацетон-метанол приводит к гораздо более стабильной иммуногистохимии, чем ацетон или только метанол.
- Промойте предметное стекло в фосфатно-солевом буфере (PBS) с 1% тритоном (без РНКазы).
- Покройте срезы 100-200 мкл PBS 1% тритоном с антителом тирозингидроксилазы, разведенным в соотношении 1:100 с 400 ЕД/мл РНКазина. Выдерживать 5-10 мин.
- Коротко промойте в PBS два раза и PBS-1% Triton.
- Покройте ткань 100-200 мкл козьего антикроличьего IgG, меченного Alexa Fluor 488, разведенного в соотношении 1:100 в PBS-1% Triton с 400 ЕД/мл РНКазина и 50 нг/мл DAPI. Инкубировать в течение 5 мин.
- Промыть 2 раза в PBS, затем обезвоживать 30 с в дозированном ряду свободного этанола РНКазы (75%-75%-95%-95%-100%-100%).
- Инкубируйте в двух промывках ксилола в течение 1 минуты, затем 5 минут.
- Снимите предметные стекла с ксилола непосредственно перед использованием для LCM и дайте высохнуть на воздухе.