Иммуногистохимия участков мозговой ткани мыши для нацеливания на дофаминовые нейроны

Аннотация

Источник: Kummari, E., et. al., Лазерная микродиссекция захвата - демонстрация выделения отдельных дофаминовых нейронов и всей вентральной тегментальной области., J. Vis. exp. (2015)

В этом видео мы демонстрируем протокол иммуногистохимии для дофаминовых нейронов в срезах ткани мозга для последующей микродиссекции лазерного захвата.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.

1. Подготовка предметных стекол и тканей

1. Используйте либо предметные стекла из силана-подготовки, либо стеклянные стекла из полиэтиленового нафталата (PEN).
2. Для выделения РНК окуните предметные стекла в раствор для обеззараживания РНКазы, промойте 3 раза водой, не содержащей РНКазы, затем обезвожьте с помощью градуированной серии этанола, не содержащего РНКазы, и высушите в вакууме в течение 30 минут.
3. Разрежьте срезы ткани толщиной 10 мкм с помощью криостата и установите на подготовленные стекол, свободные от РНКазы. Держите срезы замороженными во время среза, чтобы сохранить качество РНК. ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что ткань находится примерно в 4 мм от краев предметного стекла, так как LCM не может удалить ткань, которая находится слишком близко к краям предметного стекла. Чтобы удалить ткань со предметного стекла PEN-мембраны, убедитесь, что ткань находится на расстоянии 4 мм от левой, верхней и нижней сторон и 7 мм от правой стороны предметного стекла, что соответствует размерам мембраны, которая не прикреплена к предметному стеклу.
4. Для выделения отдельных клеточных популяций с помощью прямой иммуногистохимии срежьте ткань либо на предметные стекла Silane-prep, либо на предметные стекла мембраны PEN. Для выделения участков ткани с использованием методов непрямой иммуногистохимии установите один набор срезов на предметное стекло Silane-prep для иммуногистохимии, а чередуйте срезы либо на предметном стекле мембраны PEN, либо на предметном стекле Silane-prep для использования для LCM.

2. Подготовка тканей к лазерному захвату – быстрая иммуногистохимия тирозингидроксилазы для прямого лазерного захвата иммунореактивных клеток

1. Обведите ткань гидрофобной ручкой и дайте высохнуть.
2. Зафиксировать ткань в растворе ацетон-метанол (1:1) при -20 °C в течение 10 мин. ПРИМЕЧАНИЕ: Наш опыт показал, что фиксация ацетон-метанол приводит к гораздо более стабильной иммуногистохимии, чем ацетон или только метанол.
3. Промойте предметное стекло в фосфатно-солевом буфере (PBS) с 1% тритоном (без РНКазы).
4. Покройте срезы 100-200 мкл PBS 1% тритоном с антителом тирозингидроксилазы, разведенным в соотношении 1:100 с 400 ЕД/мл РНКазина. Выдерживать 5-10 мин.
5. Коротко промойте в PBS два раза и PBS-1% Triton.
6. Покройте ткань 100-200 мкл козьего антикроличьего IgG, меченного Alexa Fluor 488, разведенного в соотношении 1:100 в PBS-1% Triton с 400 ЕД/мл РНКазина и 50 нг/мл DAPI. Инкубировать в течение 5 мин.
7. Промыть 2 раза в PBS, затем обезвоживать 30 с в дозированном ряду свободного этанола РНКазы (75%-75%-95%-95%-100%-100%).
8. Инкубируйте в двух промывках ксилола в течение 1 минуты, затем 5 минут.
9. Снимите предметные стекла с ксилола непосредственно перед использованием для LCM и дайте высохнуть на воздухе.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Silane prep-slides	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	S4651
95% Ethanol-RNase Free	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	E7148
100% Ethanol-RNase Free	Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури	E7023
Rnase Free Triton	Sigma-Aldrich, Сент<Луис, Миссуриtd
Антитела к антитирозингидроксиазе	EDM Millipore, Billerica, MA	Ab152
Alexa Fluor 488 коз против кроликов IgG	Life Technologies, Гранд-Айленд, Нью-Йорк	А-11008
RNaseZap	Life Technologies, Гранд-Айленд, Нью-Йорк<

style='width:186pt;'>T8787td style='width:186pt;'>AM9780