Изучение переноса мембранных белков в клетках фоторецепторов дрозофилы

Аннотация

Источник: Вагнер, К. et al., Изучение переноса мембранных белков в клетках фоторецепторов дрозофилы с использованием белков, помеченных eGFP. J. vis. Exp. (2022).

В этом видео демонстрируется визуализация переноса мембранных белков в клетках фоторецепторов дрозофилы с использованием белков TRPL, меченных eGFP. В нем подробно описывается подготовка трансгенных мух к визуализации, получение флуоресцентных изображений фоторецепторных клеток и количественная оценка трафика TRPL путем измерения относительной флуоресценции eGFP в рабдомерах.

Протокол

1. Общие соображения

1. Используйте запасы дрозофилы, экспрессирующие постоянно рабдомерно расположенные транслокационные белки, для анализа переноса белка (например, ионный канал транзиентного рецептора-потенциала-подобного (TRPL):: усиленный зеленый флуоресцентный белок (eGFP), Арестин 2 ( Arr2)::eGFP).
2. Предопределите условия воздействия света выбранных мух для экспериментального подхода.
   1. Для темной адаптации держите мух в темных коробках в течение желаемого периода при температуре 25 °C. Для освещения до 16 часов в экспериментах по транслокации (например, TRPL::eGFP экспрессирующих мух) держите мух под флуоресцентной трубкой при комнатной температуре.
   2. Для подсветки мух цветным светом используйте прозрачные пластиковые коробки разных цветов вместе с люминесцентной трубкой.

2. Водно-иммерсионная микроскопия

1. Подготовка к полету
   1. Подготовьте рабочее место с необходимым оборудованием и реагентами, как показано на рисунке 1. Перенесите мух с заданным возрастом и условиями освещенности в предварительно охлажденную центрифужную пробирку объемом 15 мл и обезболите, инкубируя их на льду в течение 15-30 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Носите с собой мух 1-дневной давности, адаптированных к темноте. Как правило, адаптированных к темноте мух следует пересаживать в холодильник с крышкой в темноте. Адаптированные к свету мухи могут переноситься на лед при комнатном освещении.
   2. Перенесите одну муху под наркозом льда головой вперед в наконечник пипетки объемом 200 мкл и осторожно подтолкните муху к кончику сжатым воздухом.
   3. Отрежьте кончик пипетки прямо перед головой с помощью скальпеля. С помощью пинцета осторожно отодвиньте мушку на несколько миллиметров от кончика. Снова отрежьте наконечник пипетки и протолкните муху обратно к наконечнику сжатым воздухом так, чтобы из наконечника пипетки выступала только головка мухи.
   4. Приклейте кусок пластилина к предметной горке и вдавите в него кончик пипетки так, чтобы левый или правый глаз мухи был направлен вверх (Рисунок 2A). Непосредственно перед получением изображения с помощью лабораторной пипетки приклейте большую каплю охлажденной воды к нижней стороне объектива для погружения в воду (рис. 2B). Немедленно приступайте к получению изображения для достижения наилучших результатов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Значительная задержка в получении изображения приводит к повторному пробуждению и движениям мухи, что может привести к размытию изображений.
      
2. Image acquisition
   1. Осторожно поместите предметный слайд с подготовленной мухой на предметный столик микроскопа и выберите цель погружения в воду.
   2. Опустите цель погружения в воду вручную, пока глаз мухи не коснется капли (Рисунок 3A, B).
   3. Включите УФ-лампу микроскопа и выберите подходящий набор фильтров. С помощью окуляров расположите муху под объективом и сфокусируйте микроскоп на поверхности глаза.
   4. Переключите путь света на камеру микроскопа и сгенерируйте живое изображение в соответствующем программном обеспечении. Отрегулируйте фокус для камеры и оцените ориентацию глаза, учитывая, что глаз должен быть направлен на объектив микроскопа радиально, как более подробно показано на рисунке 3C-E.
   5. Используйте соответствующую таблицу LUT (таблицу поиска) в программном обеспечении для обработки изображений для обнаружения перенасыщения (обозначено красными пикселями).
   6. В случае непигментированных мух, отрегулируйте время экспозиции так, чтобы самые яркие пиксели были чуть ниже предела насыщенности для каждого изображения.
   7. Запишите изображение и сохраните его как необработанный файл, чтобы архивировать все соответствующие метаданные записи. Экспортируйте изображение в формате .tif для следующей количественной оценки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Освещайте мух в течение 5 минут красным светом (например, 630 нм) сразу после получения изображения, если они предназначены для использования для дальнейших экспериментов. Красный свет деактивирует каскад фототрансдукции, который был чрезмерно активирован интенсивным коротковолновым светом во время получения изображения.
      
3. Анализ данных и количественная оценка относительной флуоресценции eGFP в рабдомерах микрофотографий погружения в воду
   1. Загрузите, установите и запустите программное обеспечение ImageJ/Fiji.
   2. Отрегулируйте настройки ImageJ, нажав на >Анализ > Установить измерения... и отметьте галочкой только поле Среднее значение серого. Импортируйте .tif изображение, нажав «Файл» > «Открыть...» или путем перетаскивания. Выберите репрезентативную область изображения, которая находится в фокусе, и увеличьте ее до 200%-300%, многократно нажимая Ctrl и + вместе.
   3. Выберите инструмент «Овал» и, нажимая клавишу Shift, сгенерируйте круговое выделение на изображении, которое значительно меньше одного флуоресцентного рабдомера. Прежде чем отпустить кнопку мыши, найдите точный размер, отображаемый под панелью инструментов в главном окне ImageJ. Используйте один и тот же размер круговой выборки для всех анализов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Точный размер круглого выделения в пикселях или микронах зависит от конкретной настройки. Используйте круг примерно на 1/3 или 1/4 от рабдомерного диаметра 1-дневной старости, адаптированной к темноте контрольной мухе.
   4. Переместите круговое выделение, щелкнув по нему мышью и перетащив его, или нажав клавиши со стрелками на клавиатуре.
   5. Чтобы измерить интенсивность флуоресценции в круговом выделении, переместите круг на первый рабдомер (r1) и нажмите на >Analyze > Measure или используйте сочетание клавиш Ctrl + M. Появится окно «Результат» со списком измеренных значений серого.
   6. Продолжайте измерения r2-r6 в виде повторных измерений и измерения фонового сигнала (b). В случае непигментированных мух проведите дополнительные измерения соответствующих участков тела клеток (c1-c6) (рис. 4).
   7. Повторите шаги 2.3.5 и 2.3.6 еще для двух омматидий, в результате чего получится три технических повторения. Отметьте проанализированные омматидии с помощью инструмента «Карандаш» и сохраните это изображение для документации.
   8. Выберите и скопируйте измеренные значения серого из окна результатов и вставьте их в программное обеспечение для работы с электронными таблицами для дальнейших расчетов. Отсортируйте значения интенсивности флуоресценции в соответствии с их происхождением по категориям рабдомер (r), тело клетки (c) и фон (b). Рассчитайте среднюю интенсивность по каждой категории (Ir, Ic, Ib).
   9. Рассчитайте относительное количество eGFP, присутствующего в рабдомере.
   10. Перейдите к следующему изображению на шаге 2.3.3. Рекомендуется использовать изображения не менее пяти особей из каждой экспериментальной группы в качестве биологических репликаций для получения надежных измерений.

Результаты

Рисунок 1: Рабочее пространство для водно-иммерсионной микроскопии. Необходимые материалы: (A) центрифужная трубка объемом 15 мл, (B) ледяные хлопья, (C) охлажденная дистиллированная вода, (

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
15 мл центрифужной пробирки	Flystuff	59-172
Лампа холодного света (KL 1500 LCD)	Zeiss		<
NIH
Флуоресцентный микроскоп с УФ-лампой, камерой, набором фильтров и программным обеспечением (AxioImager.Z1m, Axiocam 530 mono, 38 HE, ZEN2 blue edition)	Zeiss	<
Люминесцентная трубка	Osram	4050300518039.00<
Eppendorf		<
Roth	656.1
Наконечники для пипеток (200 μL)	Labsolute	7695844	<
Bostik	30811745	<
<
Стереомикроскоп с УФ-лампой, камерой, комплектом фильтра и программным обеспечением (MZ16F, MC170 HD, GFP3, LAS 4.12)	Leica	<

td style='border-top-style:none;height:14.25pt;'>Fiji/ImageJtd style='border-left-style:none;'> td style='border-left-style:none;'> <td style='border-top-style:none;height:14.25pt;'>Лабораторная пипетка (20-200 μL)td style='border-top-style:none;height:14.25pt;'>Object slidetd style='border-top-style:none; height:14.25pt;'>Plasticine (Blu-Tack)td style='border-top-style:none;height:14.25pt;'>Стереомикроскоп (SMZ445)<td style='border-left-style:none;border-top-style:none; '>Nikontd style='border-left-style:none;'> td style='border-left-style:none;'>