Обнаружение модификаций гистонов в дрожжевых клетках с гиперэкспрессией нейродегенеративных белков

Аннотация

Источник: Bennett, S. A., et al., Характеристика посттрансляционных модификаций гистонов в моделях нейродегенеративной протеинопатии дрожжей. J. Vis. Exp. (2019).

В этом видео показана процедура оценки модификаций гистонов в дрожжевых клетках с гиперэкспрессией нейродегенеративных белков. Этапы включают лизис клеток, центрифугирование, электрофорез, перенос мембраны и обнаружение модифицированных гистонов на основе антител.

Протокол

1. Лизис клеток и вестерн-блоттинг для выявления посттрансляционных модификаций гистонов

1. Лизис клеток
   1. Размораживание клеточных гранул дрожжей на льду и ресуспендирование клеточных гранул в 100 мкл dH₂O.
   2. К клеточной ресуспензии, добавить 300 мкл 0,2 М NaOH и 20 мкл 2-меркаптоэтанола. Восстановите суспендию с помощью пипетирования вверх и вниз.
   3. Инкубируйте клетки на льду в течение 10 минут, а затем центрифугируйте при 3 200 x g на настольной центрифуге в течение 30 с при RT. Выбросьте надосадочную жидкость.
   4. Повторно суспендируйте гранулу ячейки в 100 мкл 1x загрузочного красителя и кипятите 10 минут на нагревательном блоке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рецепт 6-кратной загрузки красителя можно найти в Таблица материалов.
2. Электрофорез и перенос мембранного геля додецилсульфат-полиакриламид натрия
   1. }Подготовьте гелевую камеру, поместив два геля в держатель геля, заполнив внутреннюю камеру доверху бегущим буфером и заполнив внешнюю камеру до отметки линии из двух гелей.
   2. Загрузите 15 мкл образца на лунку в 10-луночный 12% полиакриламидный гель. Для белковой лестницы загрузите 5 μл.
   3. Запустите гель примерно на 45 минут при 150 В или до тех пор, пока фронт загружаемого красителя не достигнет дна геля.
   4. Пока гель работает, подготовьтесь к переносу мембраны, замочив волокнистые прокладки (по две на гель) в буфере для переноса (Table of Materials) и замочив мембрану из поливинилиденфторида (PVDF) в метаноле. Промойте мембрану в буфере для переноса перед переносом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мембрана PVDF должна быть обрезана по размеру геля и использовать одну мембрану PVDF для каждого переносимого геля.
   5. Соберите на полусухую ячейку передаточного аппарата «бутерброд»: с нижнего электрода поместите (1) предварительно замоченную волокнистую прокладку, (2) предварительно замоченную и промытую мембрану из ПВДФ, (3) гель и (4) вторую предварительно замоченную волокнистую прокладку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать образования пузырьков воздуха в «бутерброде» для переноса, осторожно скатайте «бутерброд» серологической пипеткой, чтобы вытеснить пузырьки. После того, как гель был помещен поверх мембраны PDVF, не перемещайте его.
   6. Чтобы осуществить перенос белка, установите блок питания на 150 мА на 1 ч (на один «бутерброд»).
3. Обнаружение посттрансляционных модификаций гистонов (ПТМ) с модификаторно-специфическими антителами
   1. Удалите мембрану из транспортного аппарата. Кратковременно прополощите dH₂O.
      1. По желанию проверьте перенос белков с пятном Ponceau-S, налив достаточно красителя Ponceau-S, чтобы покрыть мембрану, в небольшую пластиковую коробку и инкубируя при RT с легким встряхиванием в течение 30−60 с. Удалите пятно Ponceau-S и прополощите dH₂O до тех пор, пока фоновое пятно не исчезнет и белковые полосы не станут видны невооруженным глазом. Продолжайте полоскать с помощью dH₂O, пока все пятна не будут удалены с мембраны.
   2. Заблокируйте мембрану, инкубируя блоттинг в течение 1 ч при RT с легким покачиванием в блокирующем буфере с трис-буферным раствором (TBS) (Table of Materials) в небольшой коробке для окрашивания. Используйте достаточный буфер блокировки, чтобы покрыть блот.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, размещайте мембрану вертикально в окрашивающей коробке так, чтобы сторона мембраны, на которой лежат белки, не была обращена вниз.
   3. Инкубируйте блот в окрашивающем боксе на ночь с антителом, специфичным для модификации гистонов, реактивным по отношению к дрожжам при 4 °C. Разведите антитело в буфере, блокирующем TBS, в соответствии со спецификациями производителя. Также включите надлежащий контроль ядерной нагрузки, такой как антиобщий H3, выращенный в другом организме-хозяине из модифицированного антитела. Например, при зондировании на H3S10ph с помощью антитела против H3S10ph, выращенного у кроликов, используйте антитело против общего H3, выращенное у мышей, в качестве контроля нагрузки. Повторяйте это для каждой блотки по мере необходимости.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разведения антител можно использовать повторно в общей сложности три раза в течение месяца. Храните их при температуре 4 °C.
   4. Промойте мембрану 4 раза в домашнем TBS + 0,1% полисорбате 20 (TBST) в течение 5 минут с покачиванием на RT.
   5. Инкубируйте блот с флуоресцентными вторичными антителами в указанных производителем разведениях (Donkey Anti-rabbit 680 и Donkey anti-mouse) в течение 1 часа в RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентные вторичные антитела должны быть защищены от света как во время хранения, так и при использовании. Проводят инкубацию в темных пластиковых ящиках или накрывают алюминиевой фольгой.
   6. Промойте мембрану 4 раза с TBST в течение 5 минут и промойте TBS в течение 5 минут, покачиваясь на RT.
   7. Визуализируйте блот на флуоресцентной системе визуализации вестерн-блоттинга в течение 2 минут. Визуализируйте вторичные антитела против кролика 680 и против мыши 800 в каналах 800 нм и 700 нм соответственно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Репликации проводятся независимо друг от друга, начиная с раздела 1. Для правильной интерпретации данных в этих экспериментах необходимо убедиться, что сигнальный ответ антитела находится в диапазоне, в котором сигнальный ответ является линейным.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
10x Running Buffer			Смесь: 141,65 г глицина (ThermoFisher BP381-1), 30,3 г основания Tizma (Sigma-Aldrich T6066), 10 г додецилсульфата натрия (Sigma-Aldrich L3771) и 1 л деионизированной воды, pH 8,8.
12% полиакриламидные гели<	456-1041	<
Sigma-Aldrich	M3148	<
MilliporeSigma	07-353 (Лот No 2762291)	Dilution: 1/1000
Anti-acetyl-Histone H4 (Lys16) Primary Antibody	Abcam	ab109463 (Лот No. GR187780)	Dilution: 1/2000
Anti-acetyl-Histone H4 (Lys12) Primary Antibody	Abcam	ab46983 (Lot No. GR71882)	Dilution: 1/5000
Anti-dimethyl-Histon H3 (Lys36) Primary Antibody	Abcam	ab9049 (Лот No. GR266894, GR3236147)	Dilution: 1/1000
Anti-Histone H3 Primary Anti-Histone Anti-Hibody	Abcam	ab24834 (Lot No. GR236539, GR174196, GR3194335)<
Anti-phospho-Histone H2B (Thr129) Первичное антитело	Abcam	ab188292 (Лот No. GR211874)	Dilution: 1/1000
Anti-phospho-Histone H3 (Ser10) Primary Antibody	Abcam	ab5176 (Lot No. GR264582, GR192662, GR3217296)<
BioPhotometer D30	Eppendorf	6133000010	<
Eppendorf	22625501
Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CW	LI-COR	926-32212 (Лот No C60301-05, C61116-02, C80108-05)	Dilution: 1/5000
Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RD	LI-COR	926-68073 (Лот No C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07)	Разбавление: 1/2500
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023	<
BIO-RAD	1703968
Мембраны для переноса Immobilon-FL	MilliporeSigma	IPFL00010
Loading Dye			Смесь: 1,2 г додецилсульфата натрия, 6 мг бромофенола синего (Sigma-Aldrich B8026), 4,7 мл глицерина, 1,2 мл 0,5 мл основания Тризмы pH 6,8, 0,93 г DL-дитиотрейтола ( Sigma-Aldrich D0632) и 2,1 мл деионизированной воды.
Methanol<	A412-4	<
BIO-RAD	1658004<
Многоканальная пипетка	Eppendorf	2231300045
Nuclease Free Water	Qiagen	129114
Odyssey Fc Imaging System	LI-COR Biosciences	2800-03
pAG303GAL-a-synuclein-GFP	Подарок от А. Гитлера
pAG303GAL-ccdB	Addgene	14133
pAG303Gal-FUS	Addgene	29614
pAG303GAL-TDP-43	Подарок от А. Гитлера	<
Poly(этиленгликоль) (PEG)	Sigma-Aldrich	P4338	Приготовьте 50% w/v раствор.
Ponceau S Stain	Sigma-Aldrich	P3504	Смесь: 0,5 г 0,1% против красителя Ponceau S, 5 мл 1% против уксусной кислоты (Sigma-Aldrich 320099) и 500 мл деионизированной воды.
PowerPac Basic Power Supply	BIO-RAD	164-5050
Буфер загрузки додецилсульфата натрия			Хранить при -20 °C. 6X, Смесь: 1,2 г додецилсульфата натрия, 6 мг бромофенола синего, 0,93 г DL-дитиотреитола, 2,1 мл деионизированной воды, 4,7 мл глицерина и 1,2 мл 0,5 м основания тризмы, pH 6,8.
Гидроксид натрия	Sigma-Aldrich	221465	Приготовьте 0.2 M раствор.
TBS + 0.1% Tween 20 (TBST)	<	Mix: 100 мл 10X TBS, 1 мл Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949) и 900 мл деионизированной воды.
TBS Blocking Buffer	LI-COR	927-5000<
Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell	BIO-RAD	170-3940	<
	<
Tris-Buffered Salt (TBS)			10X, 7.6 pH, Раствор: Смешайте 24 г основы Тризмы и 88 г хлорида натрия (Sigma-Aldrich S7653). Наполните до 1 л деионизированной водой.
WT 303 S. cerevisiae yeast	Подарок от J. Shorter

td style='width::108pt;'>BIO-RADtd style='height:15.5pt;width:135pt;'>2-mercaptoethanoltd style='height:46.5pt;width:135pt;'>Anti-acetyl-Histon H3 (Lys14) Primary Antibodytd style='width:314pt;'>Контроль ядерной нагрузки; Разбавление: 1/2000td style='width::314pt;'>Dilution: 1/1000td style='height:31.0pt;width:135pt;'>Centrifuge 5804/5804 R/5810/5810 Rtd style='height:31.0pt;width:135pt;'>Extra thickblot paper (фильтровальная бумага)td style='width:108pt;'>ThermoFishertd style='height:15.75pt;width:135pt;'>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoeresis Celltd style='width:314pt;'> td style='width:314pt;'> td style='width:108pt;'> td style='width:314pt;'> td style='height:15.75pt;width:135pt;'>Transfer Buffertd style='width:314pt;'>Смесь: 22,5 г глицина, 4,84 г основы Tizma, 400 мл метанола, 1 г додецилсульфата натрия и 1,6 л деионизированной воды.