Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Испытуемые
- Используйте самцов крыс Спрэг-Доули (250-300 г по прибытии).
- Содержать крыс в клетках с твердым дном в помещении колонии с влажностью 40-60% и комнатной температурой (RT) 21 ± 1 °C.
- Обеспечьте доступность воды и пищи в свободное время.
- Держите крыс в обратном цикле темный/световой 12:12 (свет включается через 20 часов).
2. Хирургическое вмешательство
- На крысу приготовьте два кусочка хромовой кишечной лигатуры (5-0) длиной примерно 6 см и поместите их в стерильный физиологический раствор, чтобы избежать высыхания и придания им жесткости и ломкости.
- Обезболивают животное пентобарбиталом (60 мг/кг, внутрибрюшинно [в/в]) и обрабатывают атропином (0,1 мг/кг, в/в). Контролируйте уровень анестезии, вытягивая одну ногу и зажимая ногтем перепонку кожи между пальцами ног, чтобы обеспечить адекватное давление. Следите за тем, чтобы животное не сгибало конечности. При необходимости дополнительно вводят пентобарбитал.
- Выбрейте голову крысы так, чтобы можно было сделать разрез кожи головы по средней линии размером примерно 25 мм с равными расстояниями спереди и сзади от центра глаз.
- Зафиксируйте голову крысы в стереотаксической рамке или иным образом зафиксируйте голову крысы. Положите крысу на подогретую подушку для поддержания температуры тела.
- Нанесите офтальмологическую мазь на оба глаза, чтобы предотвратить высыхание повреждений.
- Потрите бритую область головы спиртом, затем бетадином.
- Сделайте разрез по средней линии кожи головы, обнажив череп и носовую кость.
- Используйте операционный микроскоп для выполнения шагов с 2.9 по 2.16.
- Рассеките свободный край орбиты, образованный верхнечелюстной, лобной, слезной и скуловой костями, с помощью тампона с ватным наконечником и пары щипцов Дюмона. Используйте тампон, чтобы впитать кровь от возможного кровотечения.
- Чтобы получить доступ к подглазничному нерву (IoN), аккуратно отклоняйте содержимое орбиты с помощью точного ватного тампона, стараясь не перенапрячь передний решетчатый нерв, который пересекается выше IoN. Рассеките IoN отдельно от окружающей соединительной ткани с помощью прецизионного тампона с ватным наконечником и пары щипцов Dumont размазывающими движениями. Используйте тампон, чтобы впитать кровь от возможного кровотечения.
- Чтобы выполнить лигирование, протолкните один конец цельного куска хромированной кишки вниз вдоль лобной кости, медиально к IoN, и продвигайтесь на несколько миллиметров параллельно и ниже IoN. Теперь лигатура удерживается на месте между IoN и лобной костью.
- Проденьте кончик щипцов Дюмона, расположенных под углом 45 градусов, под IoN, чтобы поместить его в непосредственной близости от лигатуры. Аккуратно втяните IoN в сторону, чтобы обнажить лигатуру и кончик щипцов. Захватите лигатуру щипцами и извлеките щипцы латерально из-под IoN.
- Вытягивайте лигатуру из орбитальной полости до тех пор, пока оба конца лигатуры не окажутся более или менее равноудаленными от IoN.
- Сделайте «скользящий узел» с двух концов лигатуры, чтобы обеспечить идеальный контроль над степенью сжатия, и сдвиньте узел против IoN. Сдвиньте узел дальше, чтобы сузить IoN так, чтобы диаметр нерва уменьшился на заметную величину. Завяжите обычный узел поверх скользящего узла, чтобы величина сужения оставалась постоянной (т.е. .,, чтобы разрезной узел не соскальзывал).
- Разрежьте лигатуры так, чтобы от узла осталось примерно 2 мм свободных концов.
- Повторите ту же процедуру (шаги с 2.11 по 2.15), чтобы сделать вторую лигацию на расстоянии 2 мм от первой.
- При фиктивной операции выполните шаги с 2.2 по 2.10.
- Закройте разрез кожи головы с помощью полиэфирных швов (4-0) и дайте крысе восстановиться на подогреваемой подушке. Не оставляйте животное без присмотра до тех пор, пока оно не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего состояния грудины, и не возвращайте животное в компанию других животных до тех пор, пока оно полностью не придет в себя.
- Чтобы избежать упреждающего обезболивающего воздействия на развитие нейропатической боли, не применяйте анальгезию при послеоперационной боли.