Создание трехмерной сфероидальной модели инвазии опухолевых клеток

Аннотация

Источник: Guyon, J., et al. 3D-модель сфероида для глиобластомы. J. vis. exp. (2020)

В видео демонстрируется создание трехмерной сфероидальной модели инвазии опухолевых клеток. Сфероиды образуются из опухолевых клеток мозга человека и встраиваются в коллагеновую матрицу. Опухолевые клетки на периферии сфероида принимают инвазивный фенотип, выделяя протеазы для разрушения коллагена и продвигаясь к вторжению в окружающий матрикс.

Протокол

1. Генерация опухолевых сфероидов одинакового размера

ПРИМЕЧАНИЕ: Стволовые клетки культивируются в нейробазальной среде с добавлением добавки B27, гепарина, фактора роста фибробластов 2 (FGF-2), пенициллина и стрептомицина. Эти клетки спонтанно образуют сфероиды в культуре.

1. Промойте опухолевые клетки 5 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) и инкубируйте клетки с 0,5-1 мл диссоциативного фермента в течение 5 минут при 37 °C.
2. Промойте 4-4,5 мл PBS и добавьте 10 мл полной питательной среды (полная нейробазальная среда, cNBM).
3. Подсчитайте ячейки, используя технику автоматического подсчета с трипановым синим цветом и слайдом камеры подсчета клеток.
4. Чтобы создать 100 сфероидов с 10⁴ клетками на сфероид (в соответствии с предпочтительным размером), смешайте 10⁶ клеток в 8 мл NBM с 2 мл 2% метилцеллюлозы.
5. Перелейте суспензию в контейнер для стерильной системы и дозируйте 100 μл/лунку с помощью многоканальной пипетки в круглую нижнюю пластину на 96 лунок.
6. Инкубируйте пластину при 37 °C, 5% CO₂ и 95% влажности. Сформируются сфероиды одинакового размера, которые можно будет использовать через 3-4 дня.

2. Трехмерные эксперименты

1. Invasion
   1. Preparation
      1. Соберите сфероиды из круглого дна лунки в пробирки объемом 500 мкл и промойте 2x 200 мкл 1x PBS.
      2. Осторожно пипетируйте сфероиды в 100 μл коллагеновой матрицы и вставьте в центр лунки в обычные 96-луночные планшеты.
      3. Инкубируйте коллагеновый гель в течение 30 минут при температуре 37 °C, а затем добавьте cNBM поверх геля. Ингибиторы или активаторы (например, хлористый водород, как показано на рисунке 1В, 1С) могут быть добавлены в среду на этой стадии.
   2. Получение и анализ изображений
      1. Делайте снимки последовательно с помощью видеомикроскопа в режиме светлого поля через 24 часа после включения коллагена.
      2. Используйте Fiji для анализа изображений вручную или в полуавтоматическом режиме. Чтобы сделать это вручную, нарисуйте вокруг ядра и общую площадь сфероида с помощью инструмента произвольного выделения и измерьте инвазивную область каждого сфероида, вычтя общую площадь из общей площади ядра. Чтобы проанализировать изображения в полуавтоматическом режиме, используйте макрос для определения инвазивной области.

Результаты

Рисунок 1: Сфероид глиобластомы P3 в анализах пролиферации, инвазии или миграции. (A) Пролиферативный анализ. Левая панель: Репрезентативные снимки с ДМСО в качестве контроля или с 20 мкМ ротенона (ингибитора комплекса дыхательной цепи I) в момент 0 или 72 ч. Правая панель: Количественная оценка площади сфероида представлена на изображениях пунктирными лин...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
96 хорошо круглодонная пластина	Falcon	08-772-212
Accutase	Gibco	A11105-01	Хранится при 4 °C, фермент диссоциации сфер
B27	Gibco	12587	Хранить при -20 °C, размораживать перед использованием
Основной фактор роста фибробластов	Peprotech	100-18B	Хранить при -20 °C, размораживать перед использованием
DPBS 10X	Pan Biotech	P04-53-500	Хранить при 4 °C
Метилцеллюлоза	Sigma	M0512	Разведен в NBM для получения 2% конечной концентрации
NBM	Gibco	21103-049	Хранится при 4 °C
Нейробазальная среда	Gibco	21103049	хранится при 4 °C
Пенициллин - стрептомицин	Gibco	15140-122	Хранится при 4 °C
Коллаген	I типаCorning	354236	хранить при температуре 4 °C