Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этике животных.
1. Извлечение α-синуклеина (αS) из рассеченных областей мозга
- Рассеките весь мозг в пластиковой чашке Петри диаметром 35 мм на льду с помощью лупы малой мощности (8-кратное увеличение) с помощью двух углублений, концы которых держатся вместе, за исключением случаев рассечения гиппокампа. Не превышайте 10 минут для сохранения целостности мозга. Поместите мозг правой стороной вверх и извлеките следующие области мозга в следующем порядке:
- Отделите одну из двух обонятельных луковиц с помощью щипцов, расположенных сразу за ней. Отделите его от мозга, переместив вниз. Повторите эту операцию для второй луковицы.
- Аккуратно вклините щипцы между двумя кортикальными элементами и сдвиньте их вперед, чтобы облегчить диссоциацию двух кортикальных отложений. Удерживая мозг на месте с помощью одного щипца, используйте другой, чтобы отделить кору головного мозга от гиппокампа.
- Расположите щипцы на 2 мм ниже коры головного мозга. Поддерживайте легкое давление на щипцы до тех пор, пока не станет видна верхняя часть гиппокампа. Снимите кожуру с первой части коры головного мозга, и повторите то же самое со второй частью. С помощью щипцов разделите две коры головного мозга, начиная с гиппокампа и двигаясь к передней части мозга.
- Расположите открытые щипцы вокруг одного из гиппокампов. Закройте щипцы в нижней части гиппокампа, затем аккуратно удалите его, максимально восстановив. Повторите процедуру для второго гиппокампа.
- Расположите открытые щипцы ниже одного из полосатых полос и аккуратно отделите его от мозга. С помощью щипцов удалите остатки коры головного мозга из стриатума. Повторите эту процедуру для второго стриатума.
- Используйте щипцы, чтобы мягко сжать контур мозжечка на 2 мм, чтобы облегчить его отделение от мозга. Поместите щипцы сразу за мозжечком и удалите их, переместив щипцы вперед.
- Используйте широкую часть щипцов, чтобы поднять мезенцефалон, чтобы четко видеть, где он соединяется со стволом мозга. Сделайте вертикальный разрез в месте соединения, затем удалите ствол мозга.
- Расположите щипцы за мезенцефалоном, который состоит из четырех закругленных структур. Надрезайте вертикально до тех пор, пока мягкий мозг не будет полностью отделен от остального мозга.
- Приготовьте гомогенаты переменного процента (вес/объем) в буфере с высоким содержанием соли (HS), в зависимости от количества доступных тканей: 5% гомогената для веса от 10 до 30 мг, 10% для веса от 30 до 80 мг и 20% для веса более 80 мг.
- Добавьте достаточный объем буфера HS в рассеченные области мозга, чтобы получить ожидаемый % гомогената.
- Vortex и проверьте, полностью ли погружены ткани в буфер HS.
- Гомогенизируйте образцы, полученные из рассеченных областей мозга или шейного отдела спинного мозга, с помощью измельчителя тканей, состоящего из трубки из боросиликатного стекла и двух пестиков, A и B.
- Вылейте каждую область мозга для измельчения прямо в пробирку. Вставьте пестик А в трубку и втяните его. Повторите это движение около десяти раз, чтобы диссоциировать ткань. Затем с помощью пестика В продолжайте растирать ткань еще 20 движений. Перенесите гомогенаты в пробирку объемом 1,5 мл с помощью пипетки для переноса объемом 1 мл.
- Центрифугируйте образцы при 1,000 x g в течение 5 минут при 4 °C, чтобы удалить любые неизмельченные фрагменты мозга. Извлеките надосадочную жидкость, разделите ее на аликвоты по 200 мкл и сохраните при температуре -80 °C для последующего анализа.
1. Определение αS с помощью ИФА
- Разбавьте антитела покрытия до 0,01 нг/мл. Используйте либо анти-αS кроличье поликлональное, либо моноклональное антитело клона 42 в 50 мМ буфере Na2CO3/NaHCO3 (pH 9,6).
- Покройте 96-луночные микропланшеты 100 μл на лунку этим раствором для покрытия и оставьте при температуре 4 °C O/N. Используйте поликлональное антитело против αS кролика в растворе покрытия для ИФА с использованием антител обнаружения syn514, клон 42, LB509, AS11, 4D6 или 8A5. Используйте клон моноклонального антитела 42 против αS в качестве покрытия в сочетании с антителом для обнаружения αS против pSer129.
ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости пластины могут храниться при температуре 4 °C в течение одной недели перед проведением ИФА. - Используйте мойку для тарелок, чтобы промыть пластины пять раз 300 μл фосфатно-солевого буфера с 0,05% Tween 20 (PBST) на лунку. С этого момента инкубация осуществляется в компании RT.
- Добавьте 200 μл блокирующего буфера T20 PBS (фосфатно-солевой буфер) на лунку. Встряхивайте в течение 1 часа при 150 об/мин. Вымойте пластины пять раз с помощью PBST.
- Разбавьте гомогенаты мозга (разбавляйте 1:100 из 20% гомогенатов, 1:50 из 10% гомогенатов и 1:25 из 5% гомогенатов в PBST BSA 1) и добавьте по 100 мкл в каждую лунку. Затем инкубируйте в течение 2 часов, встряхивая со скоростью 150 об/мин. Вымойте пластины пять раз с помощью PBST.
- Добавьте различные антитела обнаружения αS в PBST с 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в разведениях, упомянутых в списке материалов. Инкубировать в течение 1 часа при 150 об/мин. Вымойте пластины пять раз с помощью PBST.
- Добавьте конъюгаты IgG HRP против мыши или против кролика, разведенные в соотношении 1:8,000 в PBST, дополненные BSA 1% в течение 1 часа при встряхивании при 150 оборотах в минуту. Вымойте пластины пять раз с помощью PBST.
- Добавьте 100 μл раствора 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (TMB) в каждую лунку и инкубируйте в течение 15 минут в темноте, встряхивая со скоростью 150 оборотов в минуту.
- Остановите реакцию, добавив 100 μл 1 N HCl на лунку, затем измерьте поглощение при 450 нм с помощью считывателя микропланшетов.
- Для анализа данных вычтите значение OD, полученное в лунке со всеми реагентами, за исключением любых образцов мозга мыши (пустой колодец), из значений OD, измеренных для каждого из анализируемых образцов.