Моделирование метастазирования опухоли головного мозга с помощью инъекции раковых клеток во внутреннюю сонную артерию

Аннотация

Источник: Lim, M., et al. Моделирование метастазирования в мозг путем инъекции раковых клеток во внутреннюю сонную артерию. J. Vis. Exp. (2022)

В этом видео мышь под наркозом подвергается хирургической процедуре, при которой раковые клетки вводятся в общую сонную артерию (CCA) для обеспечения адресной доставки в мозг. Процедура включает в себя точное наложение швов и манипуляции с сонными артериями, чтобы направить введенные клетки к внутренней сонной артерии (ICA), способствуя образованию опухоли в мозге с течением времени.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Подготовка раковых клеток к инъекции

ПРИМЕЧАНИЕ: {{}}}В этом исследовании использовалась клеточная линия рака молочной железы человека, BT-474 (BT474). BT474 культивировали в полной питательной среде, содержащей среду RPMI (Roswell Park Memorial Institute Medium) 1640 с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки и 1% инсулина. Клетки содержались в инкубаторе при температуре 37 °C с 5% углекислого газа в атмосфере воздуха. Аутентифицируйте клеточную линию с помощью спутникового тандемного повторного тестирования, подтвердите экспрессию репортерного белка (например, люциферазы), если таковой имеется, и проверьте наличие микоплазменной инфекции.

1. Высейте раковые клетки BT474 с плотностью посева 2,0 × 10^6 клеток в колбу T75 с использованием 10 мл полной питательной среды и культуры (при 37 °C с 5% углекислого газа) до 70%-80% конфлюенции перед инъекцией.
2. В день инъекции выбросьте питательную среду и дважды промойте монослой клеток фосфатно-солевым буфером (PBS).
3. Добавьте 5 мл предварительно подогретого реагента для диссоциации клеточной культуры и инкубируйте при 37 °C в течение 5 мин или до тех пор, пока клетки не отделятся. Через 5 минут осторожно постучите по колбе, чтобы помочь отслоению клетки.
4. Добавьте 5 мл полной питательной среды, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, для гашения активности диссоциационного реагента.
5. Аккуратно ресуспендируйте клетки с помощью пипетирования, чтобы уменьшить скопление клеток.
6. Перенесите клеточную суспензию в пробирку объемом 50 мл и центрифугируйте при температуре 180 x g в течение 3 минут при комнатной температуре.
7. Сцедите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в 10 мл сбалансированного солевого раствора Хэнка (HBSS) без кальция и магния, чтобы свести к минимуму комкование клеток.
8. Центрифугируйте клеточную суспензию при комнатной температуре при 180 x g} в течение 3 мин.{{}}
9. }Сцедите надосадочную жидкость для удаления остатков сыворотки/диссоциативного реагента и ресуспендируйте клеточную гранулу в 3 мл HBSS.
10. Поместите клеточный фильтр 100 мкм на свежую коническую пробирку объемом 50 мл и пропустите клеточную суспензию для удаления клеточных комков.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Суспензия одиночных клеток необходима для минимизации окклюзии кровеносных сосудов и риска инсульта при инъекции.
11. Рассчитать количество жизнеспособных клеток можно с помощью исключения Trypan Blue и гемоцитометра стандартными методами.
12. Разбавьте клеточную суспензию HBSS до клеточной концентрации 2,5 x 10⁶ клеток/мл.
13. Держите трубку горизонтально на льду и периодически осторожно покачивайте трубку, чтобы свести к минимуму комкование. Суспензию клетки можно хранить на льду не более 6 часов.
    {{}}{{TAG_133 TAG_134}}ПРИМЕЧАНИЕ: Раскачивание выполнялось вручную, но это также можно сделать с помощью шейкера на низких оборотах.

2. Подготовка мыши к процедуре

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании использовались самки мышей NOD scid в возрасте 4-5 недель. За 3 дня до процедуры вводите мышам мягкую диетическую восстанавливающую пищу (например, диетический гель, гидрогель, пюре из мышиного чау), чтобы стимулировать кормление после процедуры.

1. Автоклавные хирургические инструменты. Распылите и протрите операционную область и оборудование дезинфицирующим средством для поверхностей, а затем 70% этанолом.
2. Подложите под операционную доску тепловой коврик для животных, чтобы предотвратить переохлаждение. Включите этот режим за 30 минут до операции. Распылите и протрите хирургическую доску дезинфицирующим средством для поверхностей, а затем 70% этанолом.
3. Подготовьте чистую клетку для содержания животного и теплую грелку для восстановления.
4. Наденьте чистые средства индивидуальной защиты (халат, маску, сетку для волос и перчатки). Поддерживайте стерильность на протяжении всей процедуры, используя чистые смотровые перчатки и технику «только наконечники инструментов».
5. Обезболивайте мышь анестезирующей камерой с использованием 5% изофлурана с потоком кислорода 2 л/мин до тех пор, пока мышь не потеряет педальный рефлекс.
6. Выньте животное из камеры и поместите его в носовой конус, поставляющий 2% изофлуран с потоком кислорода 2 л/мин для оставшейся хирургической процедуры.
7. Ушные пробивки мыши для идентификации и используйте электрические машинки для стрижки шерсти в области шеи. Очистите лишние волосы с открытых участков кожи с помощью ленты.
8. Взвесьте мышь для расчета необходимых доз обезболивающих и обезболивающих препаратов. Вводите бупренорфин и мелоксикам в дозах 50 мкг/кг и 1 мг/кг соответственно путем подкожного введения.
9. Переложите мышь на теплую операционную доску и закрепите носовой конус скотчем.
10. Нанесите на глаза глазную смазку, чтобы предотвратить высыхание.
11. Аккуратно закрепите мышь, сначала зацепив верхние зубцы резцов с помощью нити, приклеенной к хирургической доске, а затем заклейте передние и задние лапы. Этот шаг удлиняет тело и сохраняет шею прямой во время процедуры.
12. Проведите предоперационную подготовку кожи, как описано ниже.
    1. Протрите шею местным антисептиком (повидон-йодом) для снижения нагрузки микрофлоры кожи и удаления выпавших волос. Очищайте от центра кожи, двигаясь наружу, чтобы предотвратить повторное загрязнение места разреза. Повторите процесс, используя 70% этанол. Выполните три чередующихся раунда йода и этанола для дезинфекции.
    2. Наложите на животное хирургическую простыню. Его вырезают и лепят из куска стерильного бумажного полотенца или автоклавного пакета.
13. Разложите стерильные бумажные полотенца или автоклавные пакеты для хирургических инструментов.
14. Проверьте наличие рефлекса via "Щипковый тест", чтобы убедиться в достаточной анестезии перед продолжением процедуры.

3. Внутренняя инъекция сонной артерии

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте для облегчения процедуры инъекции использовалась инфузионная канюля 31 G и шприц-драйвер, активируемый ножкой. Эта настройка не является обязательной, и пользователь может использовать инсулиновый шприц 31 г и пропустить шаги 3.11 и 3.12. Чтобы приготовить канюлю для инфузии, вытяните и отделите часть иглы от подходящей части иглы 31 G с помощью двух пар зажимов для швов. Затем прикрепите часть иглы к одному концу тонкой инфузионной трубки длиной примерно 10 см.

1. Расположите диссекционный микроскоп над мышью.
2. С помощью ножниц сделайте вертикальный разрез 15 мм по средней линии в области шеи, начиная от 5 мм ниже челюсти до грудного входа.
3. С помощью двух пар угловых щипцов раздвиньте кожу и нижележащие слюнные железы и наложите ретракторы, чтобы держать трахею открытой. На следующем этапе обнажится сонная артерия, которая лежит параллельно трахее.
4. С помощью двух пар щипцов под тонким углом тупо рассеките мышечную и жировую ткань, прилегающую к трахее, чтобы обнажить правую сонную влагалище. Сонная артерия представляет собой волокнистый слой, покрывающий общую сонную артерию, вену и блуждающий нерв, и этот пучок можно визуализировать по ярко-красной общей сонной артерии. В данном исследовании инъекция выполнялась в правую сонную артерию.
5. Очистите сегмент общей сонной артерии каудально от каротидной бифуркации окружающей фасции и отделите его от блуждающего нерва и вен.
6. Изолируйте и очистите бифуркацию сонной артерии (соединение, соединяющее наружную и внутреннюю сонные артерии) от окружающих нервов и фасций. Расположите тонкие щипцы под наружной сонной артерией и проведите шелковый шов (толщиной 5-0) под артерией. Завяжите узел и затяните шов и обрежьте лишнюю леску.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта лигатура (L1) предотвратит прохождение инъекции через наружную сонную артерию.
7. Расположите тонкие щипцы под общей сонной артерией и проведите шелковый шов (толщиной 5-0) под артерией. Завяжите узел и затяните шов в положении, проксимальном к предполагаемому месту инъекции. Разрежьте лишний шов, оставив около 10 мм линии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта вторая лигатура (L2) ограничит кровоток и кровотечение после инъекции. Он также используется для позиционирования и удержания сонной артерии во время инъекции.
8. Отрежьте и смочите полоску (автоклавных) одноразовых дворников с низким ворсом размером примерно 10 мм х 5 мм. Сложите полоску размером 4 мм x 5 мм, толщиной 2-3 мм, и поместите ее под сонную артерию в предполагаемом месте инъекции. Это будет поддерживать сосуд во время инъекции.
9. На общую сонную артерию рострально к предполагаемому месту инъекции поставьте третью лигацию (L3) с ослабленным узлом. Это затягивается только после инъекции (на шаге 3.16).
10. Осторожно перемешайте клеточную суспензию и наберите 200 мкл клеточной суспензии в инсулиновый шприц (с помощью иглы 31 G).
11. Загрузите шприц в драйвер шприца, который подключен к активирующей ножной педали.
12. Прикрепите к шприцу тонкую канюлю с иглой 31 G и загрунтуйте линию.
13. Проверьте, правильно ли расположена сонная артерия и находится ли она под давлением.
14. С помощью двух щипцов под тонким углом, один из которых мягко натягивается на конец первой лигатуры, а другой удерживает иглу 31 G, медленно введите иглу скосом вверх в просвет кровеносного сосуда, стараясь не проколоть его.
15. Медленно вводите 100 мкл клеточной суспензии (начиная с шага 1.13) в общую сонную артерию со скоростью 10 мкл/с. Это доставит 2,5 × 10^5 клеток в кровеносный сосуд. Успешная инъекция визуализируется via} очищение крови от сонного кровеносного сосуда.
16. Осторожно поднимите и затяните ослабленную лигатуру (L3) (из шага 3.9) сразу после извлечения иглы, чтобы предотвратить обратный поток и кровотечение. Обрежьте лишний шов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нормально наблюдать небольшое количество крови, выделяющейся после извлечения иглы. Тем не менее, после затягивания третьей лигатуры не должно быть никаких активных кровотечений.
17. Снимите кусок увлажненных одноразовых дворников с низким ворсом.
18. С помощью пипетки Р200 дважды прополощите операционную полость 150-200 мкл стерильной воды или физиологического раствора.
19. Еще раз проверьте наличие кровотечения, а затем удалите втягивающие устройства.
20. Переместите мягкие ткани, слюнные железы и кожу над сонной артерией и трахеей.
21. Закройте слой кожи разреза с помощью иглодержателя для наложения швов, щипцов и рассасывающегося или нерассасывающегося шовного материала из моноволокна 6/0 непрерывным способом.
22. Выбросьте шприц с иглой канюли и приготовьте новую установку для следующей мыши. Использование нового шприца гарантирует, что количество клеток, вводимых в каждую мышь, будет постоянным.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Репрезентативные снимки процедуры находятся в Если сосуд проколот или разорван иглой, на что указывает утечка инъекции или кровотечение, процедура считается неудачной. Вслед за этим иглу необходимо извлечь, а третью лигатуру сразу же затянуть, чтобы предотвратить дальнейшее кровотечение. Если после затягивания шва кровотечение не прекращается, животное необходимо усыпить пентобарбиталом.

4. Восстановление после инъекции

1. Введите бупренорфин (50 мкг/кг) и мелоксикам (1 мг/кг) через подкожную инъекцию подкожно в качестве послеоперационной боли.
2. Переместите животное в теплую и чистую клетку, чтобы восстановиться после анестезии. Для животного нормально проявлять подавленную активность (сбиваться в кучу и неактивно или медленно двигаться) после пробуждения.
3. Через 30-45 мин переведите мышей в помещение для длительного содержания.
4. Обеспечьте мышей щадящей диетой (диетический гель, гидрогель, мешанка) в течение как минимум недели после операции и ежедневно проверяйте физическое состояние, уделяя особое внимание признакам инсульта, инфекции и кровотечения вокруг раны.
5. Через два дня после операции у животного обычно наблюдается снижение активности, легкая взъерошенная шерсть и потеря 15% предоперационной массы тела. Принимайте анальгетик (мелоксикам) ежедневно в течение 2-3 дней после операции, чтобы облегчить боль и ускорить восстановление.
6. Начиная с 3-го дня, животные должны восстановить активность, увеличить частоту кормления и груминга, а также снова набрать вес. Усыпляйте животных с сохраняющимися нарушениями физического состояния (боль, сгрудившиеся, малоподвижные, потеря веса) через 4 дня после операции путем внутрибрюшинной инъекции пентобарбитала натрия в дозе 200 мг/кг }.
7. Приживление и прогрессирование опухоли можно контролировать с помощью анестезии и методов визуализации по выбору, таких как биолюминесцентная визуализация, МРТ или ПЭТ/МРТ. Потребность и возможность проведения такой визуализации будут по своей сути зависеть от целей конкретного проекта и объекта, в рамках которого он проводится, а также в зависимости от типа репортерной метки, используемых клеточных линий, доступности соответствующих радиохимических и ядерных средств визуализации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые животные могут плохо реагировать и испытывать инсульт, несмотря на успешную процедуру. После процедуры животные с любыми симптомами неврологического расстройства (поворот головы и дергание в одну сторону, круговое поведение, перекатывание, биение, потеря двигательной функции) должны быть немедленно усыплены.

Результаты

Рисунок 1: Схематическое изображение протокола инъекции внутренней сонной артерии при метастазировании в головной мозг. Инъекция внутренней сонной артерии с лигированием наружной сонной артерии может надежно создать модель метастазов в мозг из различных первичных раковых опухолей. В этом протоколе на сонную артерию накладываются три лигатуры (н...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
30G игла Microlance	BD	23748
31G Ultra-Fine II инсулиновый шприц	BD	326103
Угловые щипцы	Proscitech	T67A-SS	Тонко заостренные, угловые без зазубрин, наконечник 18 мм, длина 128 мм
Животный тепловой коврик
Антибиотик и антимикотик	ThermoFisher Scientific	15240062
BT-474 (HTB-20) клеточная линия рака молочной железы	ATCC	HTB-20
Бупренорфин (TEMGESIC)
Countess cell counter	ThermoFisher Scientific	C10227
Dissection microscope
Ear
Электрические машинки
Щипцы под тонким углом	Proscitech	DEF11063-07	под углом 45°, Наконечник гладкий, Ширина наконечника: 0.4 мм, Размер наконечника: 0.4 x 0.3 мм, длина 9 см
Тонкая трубка для канюли, Наружный диаметр трубки (вход) 1/32, Внутренний диаметр трубки (вход) 1/100in	Cole Parmer	EW-06419-00
Фетальная бычья сыворотка	ThermoFisher Scientific	26140079 <
ThermoFisher Scientific	14170120
Isoflurane
Kimwipes Одноразовые салфетки с низким ворсом	Kimberly Clark- Kimwipes	Z188964
Mashed mouse chow
Meloxicam (METACAM)
Носовой конус			Изготовлен из микрофуговой пробирки
PAA глазная смазка (Carbomer 2mg/g)	Bausch and lomb
Раствор повидона-йода	Betadine	2505692
PPE (перчатка, маска, халат, сетка для волос)
Ретракторы	Kent Scientific	SURGI-5001
RPMI 1640 Media	ThermoFisher Scientific	11875093
Шелковый шовный материал 13mm 5-0, P3, 45cm	Ethicon	JJ-640G
Стерильный нормальный физиологический раствор	ThermoFisher Scientific	TM4469
Липкая лента
Хирургическая доска			Разделочная доска, обернутая автоклавируемым пакетом.
Хирургические ножницы	Proscitech	T104	Размеры наконечника (LxD): 38x7 мм, длина 115 мм
Щипцы для швов/ Изогнутые щипцы Brophy	Proscitech	T113C	Изогнутые, Закругленный узкий наконечник 2 мм, с зазубринами, длина 165 мм
Иглодержатель для швов (иглодержатель Olsen Hegar)	Proscitech	TC1322-180	длина 190 мм, зажим для трещотки
Драйвер шприца с ножной педалью/ UMP3 Ultra micro pump	World Precision Instruments	UMP3-3
T75 колба для культуры тканей	ThermoFisher Scientific	156499
Thread
Trigene II дезинфицирующее средство для поверхностей	Ceva

перфоратор для стрижки td style='height:14.5pt;'>Hank's Balanced Salt Solution без кальция и магния