ЖХ-МС/МС Анализ протеомного профиля гранул нейромеланина, выделенных из ткани головного мозга человека

Аннотация

Источник: Вульф, М., et.al. Протокол на основе лазерной микродиссекции для ЖХ-МС/МС анализа протеомного профиля гранул нейромеланина. J. Vis. Exp. (2021).

В этом видео демонстрируется анализ образцов пептидов из гранул нейромеланина (NMG), выделенных из посмертной ткани мозга человека. Пептиды сначала разделяют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), а затем анализируют с помощью масс-спектрометрии для определения их отношения массы к заряду (m/z). Целевые пептиды фрагментируются для идентификации посттрансляционных модификаций, а полученные данные сравниваются с референсной базой данных для определения протеомного профиля НМГ.

Протокол

1. Триптическое пищеварение

1. Разморозьте образцы на льду.
2. Полностью высушите образцы в вакуумном концентраторе.
3. Заполните образец 50 мкл подходящего буфера для сбраживания, например, 50 мМ бикарбоната аммония.
4. После добавления 1,25 мкл 200 мМ 1,4-дитиотреитола инкубируйте образцы в течение 30 минут при 60 °C и 300 об/мин с помощью термомиксера, а затем охладите их до комнатной температуры (RT).
5. Затем инкубировать образцы при ОТ в течение 30 мин в темноте после добавления 1,36 мкл 0,55 М йодоацетамида.
6. Добавьте подходящее количество трипсина в образцы и инкубируйте образцы в течение ночи (~16 часов) при 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для 1 000 000 мкм², 0,1 мкг трипсина оказалось достаточно.
7. Добавьте в образцы 2,6 мкл 10% трифторуксусной кислоты (ТЖК) для остановки разложения (конечная концентрация 0,5% ТЖК).
8. Полностью высушите образцы с помощью вакуумного концентратора. Затем заполните образцы до определенного конечного объема 0,1% TFA. Образцы NMG заполняли до 20 мкл, из которых 5 мкл использовали для одного масс-спектрометрического (МС) эксперимента.
9. Храните образцы при температуре -80 °C до дальнейшего использования. Определите концентрацию пептидов с помощью аминокислотного анализа или другого подходящего метода количественного определения (например, Direct Detect).
ПРИМЕЧАНИЕ: Малое количество образцов может быть не поддающимся количественной оценке с помощью упомянутых методов. Чтобы обеспечить идентичную загрузку образца, каждый образец должен содержать одинаковое количество изолированной ткани, и каждый образец должен обрабатываться одинаково.

2. Высокоэффективная жидкостная хроматография и масс-спектрометрия

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие масс-спектрометрические (МС) высокопроизводительные жидкостные хроматографии (ВЭЖХ) оптимизированы для конкретной системы LC с использованием устройства с улавливающей колонкой и масс-спектрометра, используемого здесь (см. Таблица материалов). Для других систем LC и MS рекомендуется адаптация параметров.

1. С помощью программного обеспечения Xcalibur отрегулируйте параметры ВЭЖХ следующим образом.
   1. Колонна ловушки: установите температуру 60 °C, расход 30 мкл/мин, рабочий буфер до 0,1% трифторуксусной кислоты.
   2. Аналитическая колонка с обратной фазой C18: установите температуру 60 °C, скорость потока 30 μл/мин, рабочий буфер A до 0,1% трифторуксусной кислоты, рабочий буфер B до 84% ацетонитрила и градиент до 5%-30% рабочего буфера B в течение 98 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Адаптация градиента может быть неизбежной и настоятельно рекомендуется при использовании различных тканей или клеток. Общее время градиента может варьироваться из-за загрузки образца в начале градиента и промывки образца в конце градиента. Общий градиент в этом протоколе состоит из 7-минутной загрузки образца и дополнительной промывки колонки в течение 15 минут, в результате чего общее время градиента составляет 120 минут.
2. Создайте метод сбора данных, зависящий от данных (DDA) с помощью XCalibur Instrument Setup, который можно найти в меню дорожной карты программного обеспечения ВЭЖХ.
3. На вкладке Глобальные параметры определите режим инфузии Жидкостная хроматография, Ожидаемая ширина пика LC (30 с) и Состояние заряда по умолчанию (2).
4. Перейдите на вкладку Параметры сканирования и добавьте следующие сканирования и фильтры в указанном порядке: MS OT, MIPS, Интенсивность, Состояние заряда, Динамическое исключение, и ddMS2 OT HCD.
   Оптимальные настройки MS и DDA могут варьироваться в зависимости от конкретного используемого масс-спектрометра, а также типа образца и поэтому должны быть адаптированы.
5. Готовят образцы путем растворения 200-400 нг пептидов образца в определенном объеме 0,1% ТФК в входных отверстиях флаконов из инертного масс-спектрометрического стекла. Если определение концентрации неприменимо из-за малого количества образца, проверьте идентичную нагрузку образца, сравнив общий ионный ток (TIC).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого откройте полученный файл масс-спектрометрических измерений в подходящем программном обеспечении, например, FreeStyle, и проверьте хроматограмму. Интенсивности должны быть сопоставимы для всех образцов. Репрезентативный TIC показан на рисунке Рисунок 1.
6. Проанализируйте необработанные данные, полученные с помощью протеомного подходящего программного обеспечения, например, MaxQuant, Progenesis QI for Proteomics или Proteome Discoverer, и выполните статистический анализ данных на основе исследовательского вопроса.

3. Анализ протеомных исходных данных с помощью MaxQuant

1. Загрузите необработанные файлы в программное обеспечение MaxQuant в заголовке необработанных данных, нажав кнопку Загрузить.
2. Назначьте имена образцов, нажав на Set Experiment.
3. Определите параметры, специфичные для группы. Во-первых, внесите изменения. Из-за обработки образца выберите Деамидирование (NQ), окисление (M) и Карбамидиметилирование (N-член) в качестве переменных модификаций, а также добавьте Карбамидометилирование (C) в качестве фиксированной модификации.
4. Выберите Трипсин в качестве фермента для переваривания в вкладке Digestion .
5. Добавьте опцию количественного определения без этикетки LFQ в Бесплатная количественная оценка . Если необходимо обработать более 10 файлов, выберите опцию Fast LFQ, чтобы сократить время обработки. Добавьте опцию iBAQ в качестве меры для количественного определения белка.
6. Убедитесь, что все остальные параметры, специфичные для группы, остаются в заводских настройках.
7. Перейдите на вкладку Глобальные параметры и добавьте файл FASTA, производный от uniprot.org, на вкладке Последовательности . Измените правило идентификатора соответствующим образом и добавьте идентификатор таксономии, в данном случае 9606 для homo sapiens.
8. Для количественного определения белка выберите пептиды Unique и Razor.
9. Убедитесь, что все остальные глобальные параметры остаются в заводских настройках.
10. Нажмите «Пуск» и получите вывод proteingroups.txt после анализа MaxQuant для дальнейшего анализа в Perseus.

Результаты

Рисунок 1: Общий ионный ток (TIC) при измерении DDA за 120 минут. Хроматограмма показывает относительное содержание ионов, соответствующих элюирующим пептидам, в д...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1,4-dithiothreitol	AppliChem	A1101
Acetonitrile	Merck	1.00029.2500	Бикарбонат аммония	Sigma-Aldrich	A6141		Муравьиная кислота
Sigma-Aldrich	56302
Iodoacetamide	AppliChem	A1666,0100<
Micro Tube 500	Carl Zeiss	415190-9221-000	Thermo Fisher Scientific	IQLAAEGAAPFADBMBHQ
PALM MicroBeam	Zeiss	494800-0014-000
Трифторуксусная кислота	Merck	91707
Trypsin sequencing grade	Serva
Ultimate 3000 RSLC nano LC system	Thermo Fisher Scientific	ULTIM3000RSLCNANO
Название программного обеспечения	Weblink/Company	Version
FreeStyle	1.6
MaxQuant	https://www.maxquant.org/	1.6.17.0
PALMRobo	Zeiss	4.6 pro
Perseus	https://www.maxquant.org/perseus/	1.6.15.0
Skyline	https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view	20.2.0.343
XCalibur	Thermo Fisher Scientific	4.3

td style='border-left-style:none;border-top-style:none;width:120pt;'>