$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Генерация опухолевых сфероидов воспроизводимого размера
- Сбор диффузной срединной глиомы (DMG) H3K27M-мутантных нейросфер (NS) и центрифуга при 170 x g} в течение 10 минут (мин) при комнатной температуре (RT).
- Чтобы разрушить НС, инкубируйте 500 мкл раствора аккутазы в течение 3 мин при 37 °C.
- }Нейтрализуйте раствор аккутазы средой для опухолевых стволовых клеток (TSM)7 и центрифугируйте клеточную суспензию при 355 x g в течение 5 min at RT.
- Повторно суспендируйте клеточную гранулу в 1 мл среды TSM, а затем обработайте клетки с помощью камеры для подсчета клеток.
- Разбавляют клеточную суспензию до получения 2,5-5 x 103 клеток/мл и затравливают 100 μл/лунку в 96-луночные круглодонные планшеты со сверхнизким прикреплением (ULA) (см. Таблица материалов). Используйте надлежащую плотность клеток для получения индивидуальных NS диаметром ~300 μм через 4 дня после посева клеток (250-500 клеток/лунка для высокоагрессивных клеток глиомы).
- Визуально подтвердите формирование НС с помощью инвертированного микроскопа через 4 дня после посева клеток.
2. Приготовление реагента для мечения антител (ALR)/комплекса антител и настройка для анализа миграции
- }Рассмотрите количество лунок для анализа и рассчитайте объем, необходимый для каждого реагента. Включите также скважины, необходимые для отрицательного контроля. Перед началом работы проверьте NS визуально с помощью инвертированного микроскопа.
- Используйте 96-луночные планшеты с плоским дном. Выполнить нанесение покрытия. Для данного исследования в качестве тонкого покрытия используется матрица базальной мембраны (BMM).
- Как только покрытие будет готово, удалите излишки покрытия BMM с помощью наконечника p200, расположив наконечник на краю лунки и избегая касания дна. При работе с несколькими лунками используйте многоканальную пипетку.
- Отрежьте кончик p200, возьмите по 50 мкл клеточной среды + NS из каждой выбранной лунки и переложите его в лунку с плоским дном с покрытием. Проверьте наличие и положение NS в каждой лунке визуально.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый NS должен быть расположен в центре скважины. Избегайте опоры на кончик на краю лунки во время перекачки, но опускайте среду по центру лунки, не касаясь дна. Для высокомигрирующих клеток рассмотрите большее количество репликатов, чем стандартные три репликации. Это связано с тем, что, когда NS находится слишком близко к краю скважины, мигрирующие ячейки могут покрывать меньшую площадь скважины. - Добавьте 100 μл стерильной воды в ALR для регидратации реагента (конечная концентрация = 0,5 мг/мл). Пипеткой перемешать раствор. ПРИМЕЧАНИЕ: Реагент светочувствительный; Поэтому держитесь в темноте. Аликвотируйте остатки реагента и храните при температуре -80 °C (избегайте замораживания и размораживания).
- Смешайте антитело с ALR в соответствующей полной среде для роста клеток в многолуночном планшете с круглым дном или в янтарной пробирке и защитите от света. Приготовьте достаточное количество для дозирования 50 μл/лунку при 3-кратной конечной концентрации анализа. Инкубировать при ОТ в течение 15 мин.
- }Разбавьте реагент-супрессор фона (BSR) в среде TSM (или подходящей питательной среде для выбранной клеточной линии) до 1,5 мМ (3x) до конечной концентрации 0,5 мМ, чтобы в конце анализа получить конечную концентрацию 0,5 мМ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Реагент чувствителен к свету. Выше приведены инструкции по обращению. - Аккуратно добавьте 50 μL BSR в каждую лунку.
- Аккуратно добавьте 50 мкл ALR/антитела в каждую лунку. Подождите 2 или 3 минуты, чтобы реагенты смешались, и проверьте визуально с помощью инвертированного микроскопа, чтобы убедиться, что большая часть репликируемых NS расположена в центре лунки.
- Избегайте образования пузырьков и удаляйте уже имеющиеся с помощью иглы. Осторожно перенесите планшет в прибор для анализа живых клеток, помещенный в инкубатор при температуре 37 °C, 5% CO2, 95% влажности.
3. Настройка прибора для анализа живых клеток для получения изображений
- Отсканируйте планшеты с помощью прибора для анализа живых клеток (технические характеристики см. Таблица материалов) с интервалами сканирования, начинающимися с нулевой точки времени (t0) установленных анализов инвазии и миграции, Соответственно, после шага 2.14. и 3.10. до 96 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что вы можете утилизировать прибор для анализа живых клеток сразу после начала анализа инвазии и миграции. В зависимости от типа опухоли клетки могут начать вторжение или миграцию из NS уже в течение 1 ч после проведения анализа. - В программном обеспечении прибора для анализа живых клеток выберите параметр Запланировать получение. Нажмите на вкладку +} и выберите опцию Сканировать по расписанию.
- В окне программы Создать или восстановить судно нажмите на опцию Новый.
- Выберите конкретное применение в инструменте анализа живых клеток для сбора данных об инвазии и миграции. Выберите Сфероид Тип сканирования, 4-кратный объектив, Фаза+Яркое поле} и Зеленый} Каналы изображения для анализа инвазии. Выберите тип сканирования Клонирование разведения, 4-кратный объектив и Фаза } и Зеленый } для анализа миграции.
- Выберите тип пластины и определите скважины для сканирования, выделив их на карте пластин.
- Настройте частоту сканирования (для экспериментов в данном протоколе частота сканирования составляла 15 мин для инвазии и 30 мин для миграции).
- Нажмите на Добавить в расписание и начните сканирование.