Мы описываем эффективный метод для отдельных одноцепочечных ДНК двухцепочечной молекулы ДНК и РНК от экологической вирусных общин. Нуклеиновых кислот фракционированного использовании гидроксиапатита хроматографии с увеличением концентрации фосфата содержащих буферы. Этот метод позволяет изоляции всех типов вирусных нуклеиновых кислот из проб окружающей среды.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Разделение одноцепочечных ДНК двухцепочечной ДНК и РНК из экологического сообщества Вирусный Использование гидроксиапатита хроматографии
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Вирусы, в частности, бактериофаги (фаги), являются наиболее многочисленными биологических объектов на 1,2 Земле. Вирусы модулировать хост обилие клеток и разнообразия, способствовать круговорот питательных веществ, изменяет фенотип клетки-хозяина, и влиять на развитие как клетки-хозяина и вирусных сообществ через боковой перенос генов 3. Многочисленные исследования выявили ошеломляющие генетического разнообразия вирусов и их функциональных возможностей в различных природных средах.
Метагеномных методы были использованы для изучения таксономического разнообразия и функциональный потенциал комплекса вирусных ассоциаций, члены которых содержат одноцепочечных ДНК (оцДНК), двухцепочечной ДНК (дц) и РНК генотипов 4-9. Текущее строительство библиотеки протоколов, используемых для изучения экологических ДНК-содержащие и РНК-содержащих вирусов требует первоначального лечения нуклеазы, чтобы удалить nontargeted шаблонов 10. Тем не менее, полное понимание коллективных дополнением гена вируса и сообщества вирус разнообразие требует знания всех членов независимо от генома композиции. Фракционирование очищенных нуклеиновых кислот подтипов обеспечивает эффективный механизм для изучения вирусных ассоциаций, не жертвуя подмножество генетической подписью сообщества.
Гидроксиапатита, кристаллической форме кальция фосфата, был принят на работу в отделение нуклеиновых кислот, а также белков и микробов, с 1960 года 11. Эксплуатируя взаимодействия зарядов между положительно заряженными Са 2 + ионов гидроксиапатита и отрицательно заряженные фосфатные основой нуклеиновые кислоты подтипов, можно преимущественно элюировать каждой нуклеиновой кислоты подтипа независимо от других. Недавно мы заняты этой стратегии самостоятельно фракционирования геномов оцДНК, двухцепочечной ДНК и РНК-содержащих вирусов в подготовке секвенирования ДНК 12. Здесь мы представляем метод фракционирования и восстановления оцДНК, двухцепочечной ДНК и РНК вирусной нуклеиновой кислоты из смешанных вирусных ассоциаций использовании гидроксиапатита хроматографии.
Протокол
1. Подготовка решений
Перед выполнением гидроксиапатита хроматографии, фосфатные буферы должны быть подготовлены и гидроксиапатита должны быть надлежащим образом обезвоживания.
- 1М раствор фосфат, рН 6,8: в 1 л колбе растворяют 119.98g натрия фосфат однозамещенный в 1 л стерильной, DEPC обработанных H 2 O. Подготовка 1M натрия фосфат двузамещенный раствора в 1 л колбе, растворяя 141.96g натрия фосфат двузамещенный в 1 л стерильной, DEPC обработанных H 2 O. Комбинат моно-и ди-решений в соотношении 1:1. Место колбы на тарелке перемешать и смешать с помощью магнитной мешалки. Отрегулируйте рН до 6,8 путем доба....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Гидроксиапатита методологии хроматографии, представленная здесь, высокоэффективный и надежный инструмент для фракционирования нуклеиновых кислот из смешанных вирусных ассоциаций, когда целью является изучение общего состава нуклеиновых кислот сообщества. Как правило, оцДНК, РНК и дц будет вымывается из колонки фотонов фосфатного буфера концентрациях, превышающих примерно ~ 0 и 0.40M соответственно. Однако, каждый подготовки гидроксиапатит может иметь несколько иной состав и профиль элюирования, поэтому важно, ч.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Работа выполнена при поддержке Управления науки (BER), Министерство энергетики США, соглашение о сотрудничестве нет. Де-FC02-02ER63453, микробного генома Национального научного фонда Секвенирование Program (награда номерами 0626826 и 0731916). Мы благодарим Джона стекло за его техническую экспертизу и консультации и К. Эрик Wommack за его помощь в экологической лаборатории.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Материал Имя | Компания | Номер по каталогу | Номер по каталогу |
| Econo-колонки | Bio-Rad | 737-0717 | 0,7 см идентификатор пакета / 2 |
| Гидроксиапатит | Bio-Rad | 130-0520 | ДНК-класса Био-гель Гель HTP, 100g/td> |
| Фосфат натрия, Монокальцийфосфат | VWR | VW1497-01 | Моногидрат, Crystal 500 |
| Фосфат натрия, Диаммоний | VWR | VW1496-01 | Безводный, порошок 500г |
| DEPC обработанной воды | Invitrogen | AM9922 | 1L |
| 10% SDS решения | Invitrogen | 24730-020 | Сверхчистых, 1л |
| 0,5 М ЭДТА | Invitrogen | AM9262 | рН 8,0, 1л |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-25МЛ | |
| 2 мл серологических pippette | VWR | 89130-884 | Полистирол, стерильная |
| BD Трубы Сокол Центрифуга | VWR | 21008-936 | 15 мл, стерильная |
| Фенол: хлороформ: изоамиловый спирт (25:24:1 о / о / о) | Invitrogen | 15593-031 | Сверхчистых, 100мл |
| Amicon Ультра-4 Центробежные устройства | Millipore | UFC803024 | Ultracel-30 мембраны |
| 20X TE буфера, РНКазы свободный | Invitrogen | T11493 | 100 мл |
| Glycoblue | Invitrogen | AM9516 | 15mg/ml |
Ссылки
- Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. Prokaryotes: The Unseen Majority. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 6578-65 (1998).
- Hendrix, R. W. Bacteriophages: evolution of the majority. Theor Popul Biol. ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
