$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Сбор нейроэндокринных опухолей тонкой кишки (SBNET) и диссоциация
- клетокПолучение резецированных образцов SBNET пациента после подтверждения опухолевой ткани из Центра хирургической патологии.
- Нарежьте SBNET на кубики по 5 мм и храните их в 25 мл среды Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/F12 в конической пробирке для транспортировки в лабораторию.
- Перенесите опухоли в DMEM, содержащий 1% фетальной бычьей сыворотки или FBS, 1% пенициллин/стрептомицин (Pen/Strep) и 1% глютамин (Wash Medium), и инкубируйте в этой среде для промывки в течение 15 минут.
- Перенесите опухоли в новую чашку и нарежьте их на кусочки диаметром менее 1 мм с помощью стерильных изогнутых ножниц.
- Переложите измельченные салфетки в новую пробирку объемом 50 мл, содержащую 25 мл промывочной среды.
- Центрифугируйте образец при 500 x g в течение 15 минут при 4 °C.
- Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулы в 10 мл промывочной среды, содержащей коллагеназу (100 Ед/мл) и ДНКазу (0,1 мг/мл).
- Дайте измельченным опухолям перевариться в инкубаторе при температуре 37 °C с медленным встряхиванием (50 об/мин) в течение 1,5 часа.
2. Культивирование SBNETs в виде сфероидов опухолей во внеклеточном матриксе (ECM)
- После завершения расщепления (шаг 1.8) центрифугируйте при 500 x g в течение 15 минут при 4 °C, выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 15 мл промывочной среды.
- Поместите сетчатый фильтр размером 70 μм поверх новой пробирки объемом 50 мл и налейте 10 мл промывочной среды на сетчатый фильтр. Потрите промывочную среду так, чтобы она покрыла боковую сторону пластиковой трубки, чтобы элементы NET не прилипли к боковой стороне пластиковой трубки.
- Фильтруем суспензию клеток через сетчатое фильтр.
- Центрифугируйте при 500 x g в течение 15 минут при 4 °C, выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте гранулу в 200 μL промывочной среды (общий объем ~ 250 μL) и поместите ее на лед.
- Перенесите 5 μL ячеек в 500 μL Wash Medium (коэффициент разбавления 1/100). Используйте разведенные клетки для подсчета клеток с помощью гемоцитометра, чтобы получить количество клеток на миллилитр. Умножьте на 100, чтобы сделать поправку на коэффициент разбавления.
- Умножьте количество клеток на мл, полученное на шаге 2.5, на общий объем клеток в суспензии, полученный на шаге 2.4 (~ 250 μл).
- Центрифугируйте при 500 x g в течение 15 минут при 4 °C, выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в жидком ECM (1 x 106 клеток/мл) и держите на льду.
- Перенесите 5-20 μL сфероидов SBNET в ECM на 96-луночный планшет и дайте жидкому ECM застыть, поместив планшет в инкубатор с температурой 37 °C на 5 минут.
- Добавьте 200 μL питательной среды SBNET (DMEM/F12 + 10% FBS + 1% PEN/STREP + 1% Glutamine + 10 мМ никотинамид + 10 мкг/мл инсулина) в каждую лунку 96-луночного планшета, содержащего сфероиды SBNET в ECM.
- В качестве альтернативы, культивируйте органоиды SBNET в среде стволовых клеток, аналогично тому, что было описано ранее для выращивания органоидов печени человека или поджелудочной железы и перечислено в Таблице материалов.
- Меняйте медиа каждые 5-7 дней.
3. Характеристика сфероидов SBNETS с помощью иммунофлуоресценции
- Перенесите органоиды, выращенные в ECM, в пробирку объемом 1,5 мл с помощью пипетки P1000.
- Центрифугируйте при 1,500 x g в течение 1 минуты и удалите надосадочную жидкость.
- Промойте органоидную культуру, добавив 1 мл фосфатного буферного раствора или PBS, перемешайте, центрифугируйте при 1,500 x g в течение 1 минуты и удалите надосадочную жидкость.
- Зафиксируйте органоиды, добавив 500 μL 4% параформальдегида, и инкубируйте в течение 15 минут.
- Промойте культуру дважды 1 мл PBS.
- Пропитайте культуру, добавив 500 μL PBS + 3% бычьего сывороточного альбумина или BSA + 0,1% Triton X 100 в течение 5 минут.
- Затем промойте три раза 1 мл PBS + 3% BSA.
- Инкубируйте в течение 1 часа с первичными антителами против синаптофизина (SYP) при разведении 1/600 или хромогранина A (CgA) и рецептора соматостатина 2 (SSTR2) при разведении 1/400 в буфере антител (2,5% бычьего сывороточного альбумина, 0,1% азида натрия, 25 мМ Tris pH 7,4, 150 мМ натрия хлорида).
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 300 μL или более раствора антитела на пробирку. - Промойте три раза с 1 мл PBS + 3% BSA.
- Инкубируйте со вторичными антителами, связанными с FITC, при разведении 1/500 в буфере для антител в течение 1 часа. Используйте 300 μL или более раствора антитела на пробирку.
- Промойте 3 раза с 1 мл PBS + 3% BSA. Обязательно сделайте аспирацию и выбросьте всю надосадочную жидкость.
- Добавьте 5 μL монтажной среды, содержащей ядерное пятно DAPI.
- Используйте пипетку P20 для переноса 5 μL сфероидов SBNET с шага 4.12 на предметное стекло и запечатайте крышкой.
- Делайте снимки с помощью флуоресцентного микроскопа с объективами 10x, 20x или 40x.