Измерение скорости потребления кислорода в острых срезах мозга мышей

Аннотация

Источник: Zhi, L. et al., Измерение скорости потребления кислорода в острых срезах стриатального тела у взрослых мышей. J. Vis. Exp. (2022).

В этом видео показано, как измерить скорость потребления кислорода митохондриями (OCR) в срезах мозга мышей полосатого тела. В нем подробно описаны этапы подготовки тканевой пластины и картриджа датчика, их загрузки в анализатор потоков, а также объясняются клеточные процессы, лежащие в основе OCR-паттернов.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.

1. Увлажните картриджные датчики (за 1 день до анализа)

1. Откройте набор для анализа внеклеточного потока (см. Таблица материалов) и снимите картридж датчика (зеленый) и рабочую пластину (чистый; Рисунок 1A). Отложите картридж датчика в сторону (датчиками вверх) и не прикасайтесь к датчикам.
2. Добавьте 600 мкл калибровочного раствора (pH 7,4) в каждую лунку коммунальной плиты. Поместите картридж датчика на верхнюю часть рабочей пластины и погрузите датчики в калибровочный раствор. Убедитесь, что треугольная выемка на пластине утилиты и картриджа датчика правильно выровнена (Рисунок 1B).
3. Запечатайте набор для анализа внеклеточного потока герметизирующей пленкой, чтобы предотвратить испарение раствора калибра, а затем поместите его в инкубатор с температурой 37 °C без добавления CO₂ или кислорода на ночь.

2. Подготовьте тканевую пластину (в день проведения анализа)

1. Откройте микропланшет для захвата островков и выньте островковую пластину для сидения на ткани.
2. Подогреть соответствующий объем (625 мкл на лунку) предварительно насыщенной кислородом модифицированной искусственной спинномозговой жидкости (ACSF, состав 140 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 2,4 мМ CaCl₂, 1,3 мМ MgSO₄, 0,3 мМ KH₂PO₄, 25 мМ глюкозы, 10 мМ HEPES, pH 7,2) буферизовать до 37 °C в пробирке объемом 50 мл. Затем добавьте БСА до конечной концентрации 4 мг/мл для приготовления дыхательного буфера. В целом, на одну пластину достаточно 50 мл.
3. Осторожно добавьте 625 мкл дыхательного буфера (предварительно насыщенный кислородом буфер ACSF с 25 мМ глюкозой и 4 мг/мл BSA) в каждую лунку островковой пластины и избегайте встряхивания пластины. Убедитесь, что на верхней части картриджа датчика нет остаточных капель и в буфере каждой лунки нет пузырьков воздуха.

3. Острая подготовка стриарного среза и установка иссеченного среза

1. }Обезглавить мышь после вывиха шейки матки и немедленно рассечь мозг в 10 мл ледяного раствора для резки, предварительно насыщенного кислородом (125 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 26 мМ NaHCO₃, 3,7 мМ MgSO₄, 0,3 мМ KH₂PO₄, 10 мМ глюкозы, pH 7,4).
2. Разрезать коронковые полосатые срезы вибратомом в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблица материалов) толщиной 150 мкм в ледяном растворе для резки, предварительно насыщенном кислородом.
3. Восстановите срезы в 50 мл оксигенированного ACSF (125 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 26 мМ NaHCO₃, 2,4 мМ CaCl₂, 1,3 мМ MgSO₄, 0,3 мМ KH₂PO₄, 10 мМ глюкозы, 2 мМ HEPES, pH 7,4) и выдерживать в растворе до 30 мин при комнатной температуре (RT).
4. После восстановления переложите ломтики в чашку Петри размером 35 мм x 10 мм с 5 мл дыхательного буфера.
5. Используйте пробивной пуансон из нержавеющей стали (например, диаметром 1,5 мм) для создания круглого кусочка ткани в нужной области разреза мозга. Держите ломтик в буфере, слегка надавливая пуансоном. Убедитесь, что пуансон надавлен достаточно сильно, чтобы разрезать ткань. Удалите оставшуюся ткань, снимите пуансон и удалите круглый кусок ткани в буфер.
6. Отрежьте самый конец наконечника пипетки объемом 1 мл, чтобы сделать отверстие диаметром 1,5-2,0 мм, и используйте его для удержания и переноса пробитого среза в верхнюю часть экрана захвата. Отсосите один кусочек пробитой мозговой ткани и осторожно поместите ткань на сетчатую сторону экрана захвата (Рисунок 2A). Экран захвата будет представлять собой круглый кусок пластика с сеткой, прикрепленной к одной стороне.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Экраны захвата включены в пакет микропланшетов (см. Таблица материалов).
7. Аккуратно используйте бумажную салфетку, чтобы быстро высушить экран захвата. Когда влага удаляется, ткань становится липкой, что позволяет срезу прикрепиться к центру сетки. Не стоит слишком сильно сушить ломтик, так как в противном случае он будет поврежден.
8. Держите срез экрана захвата пинцетом вниз и поместите его в одну из лунок инкубационной островковой пластины (Рисунок 2B). Будьте осторожны, чтобы не уронить ломтик; Если это так, выньте экран и положите на него новый ломтик.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не размещайте срезы мозга в двух лунках коррекции фона (A1 и D6) в островковой пластине.
9. Перед проведением анализа инкубируйте островковую пластину при температуре 37 °C в инкубаторе не менее 30 минут, чтобы обеспечить равновесие температуры и pH.

4. Загрузка картриджей с желаемыми соединениями

1. Разбавьте желаемые соединения в модифицированном ACSF (37 °C) до конечной исходной концентрации 10x, 11x, 12x и 13x от рабочей концентрации для портов от A до D, соответственно, и отрегулируйте до pH 7,4. В ходе испытания соединения будут вводиться по порядку из порта А в порт D. Для этого эксперимента были использованы следующие растворы с соответствующими рабочими концентрациями, указанными перед ними: 10 мМ пирувата (порт А), 20 мкМ олигомицина (порт В), 10 мкМ или другие концентрации карбонильцианида 4-(трифторметокси) фенилгидразона (ФКХП) (порт С) и 20 мкМ антимицина А (порт D).
2. Аккуратно загрузите 75 мкл разбавленных соединений в соответствующие отверстия для впрыска картриджа датчика. Поместите наконечники наполовину в отверстия для инъекций под углом 45° так, чтобы наконечник прилегал к стенке отверстия для инъекций. Наконечники не следует полностью вставлять на дно отверстий для впрыска, так как это может привести к утечке соединения через порт.
3. Осторожно извлекайте наконечники из портов, чтобы избежать образования пузырьков воздуха. Не прикасайтесь к какой-либо части картриджа, чтобы избежать образования пузырьков воздуха.
4. Визуально осмотрите отверстия впрыска для равномерной загрузки. Убедитесь, что вся жидкость находится в порту и на верхней части картриджа нет остатков капель.
5. Поместите картридж датчика на рабочую пластину и поместите его в инкубатор (без CO₂) на 30 минут, чтобы он снова нагрелся до 37 °C. Обращайтесь осторожно, держась только за рабочую пластину. Двигайтесь как можно меньше.

5. Калибровка и выполнение анализа

1. Загрузите шаблон анализа в программное обеспечение. Нажмите зеленую кнопку START .
2. Убедитесь, что загружен правильный протокол. Протокол содержит комбинацию последовательностей измерений в течение 3 минут, ожидания в течение 3 минут и 2 минут измерения (эти три шага образуют одно измерение). Измените расстояние между головкой щупа от 26 600 до 27 800 в настройках оборудования в разделе Настройки прибора. Нет необходимости менять головку щупа для анализатора XFe24. Нажмите СТАРТ.
3. Загрузите картридж датчика на рабочей пластине в лоток для приборов. Вырез идет в переднем левом углу. Убедитесь, что пластина сидит правильно и ровно. Загрузите заполненный лекарством картридж датчика в анализатор для калибровки.
4. Следуйте инструкциям на экране для калибровки и балансировки датчиков. Это занимает около 30 минут.
5. После завершения калибровки снимите калибровочную пластину и замените ее островковой пластиной (содержащей срезы сетки и ткани).
6. Измерьте потребление кислорода в каждой лунке планшета с помощью протоколов анализа. Протокол содержит комбинацию последовательностей измерений в течение 3 минут, 3 минут ожидания и 2 минут измерения (эти три шага образуют одно измерение), после чего рассчитывается скорость потребления кислорода (OCR).
7. Для всего эксперимента включите 4 измерения OCR для создания исходного уровня, за которыми следует инъекция порта A (пируват) с 4-кратным измерением, затем инъекция порта B (олигомицина) с 8-кратным измерением, затем инъекция порта C (FCCP) с 5-кратным измерением и, наконец, инъекция порта D (антимицин A) с 6-кратным измерением.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это количество измерений после каждого впрыска соединения определяется в зависимости от того, когда измерение достигает плато.
8. Анализируйте данные измерений OCR и данные об эффективности соединения.

Результаты

Рисунок 1: Изображения, показывающие датчики и пластину картриджа с гидратом анализатора внеклеточного потока. (A) Картридж датчика сидит на калибровочной пластине (утилитарной пластине). (B) Вид сбоку на служебную пласт...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Accumet AB150 pH-настольный измер<	13-636-AB150	To measure pH
Antimycin A от Streptomyces sp.	SIGMA	A8674	Для ингибирования комплекса III митохондрий
Bovine Serum Albumin (BSA)	SIGMA	A6003	Чтобы сделать модифицированную искусственную жидкость для спинного мозга (BSA-ACSF)
Карбонильный цианид 4-( трифторметокси) фенилгидразон (FCCP)	SIGMA	C2920	Чтобы разъединить митохондриальное дыхание
D-Glucose	SIGMA	G8270	Чтобы сделать искусственную спинномозговую жидкость (ACSF)
DMSO	D8418	To dissovle compounds
HEPES	SIGMA	H3375	Чтобы создать искусственную спинномозговую жидкость (ACSF)
Увлажненный инкубатор без углекислого газа	Фишер Scientific	11-683-230D	Для увлажнения тарелок при 37 °C
Олигомицин из Streptomyces diastatochromogenes diastatochromogenes.	SIGMA	O4876	Для ингибирования митохондриальной АТФ-синтазы
Parafilm	SIGMA-ALDRICH	<
Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL	103681-100	Решение для калибровки морского конька
Seahorse XF Анализатор внеклеточного потока	Seahorse Bioscience	<
Seahorse XFe24 Анализатор внеклеточного потока	Seahorse Bioscience		Оборудование, используемое для анализа скорости потребления кислорода, новое поколение<
Seahorse Bioscience	101174-100	Упаковка картриджей для датчиков flux, планшетов для культивирования тканей, экранов захвата, калибровочного раствора и калибровочных планшетов; набор для анализов.
Sodium pyruvate<	P2256	Чтобы предотвратить любые ограничения поставки субстрата
Отверстия для биопсии нержавеющей стали	Miltex		Устройство, используемое для пробивания ломтиков<
Eppendrof	='overflow:hidden;>>30700102 align
Leica	VT1200	To cut brain tissue
Водяная баня: баня с водой;	Thermo Scientific Precision	282-115	Для нагрева буфера и растворов

td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;'>Thermo Fisher Scientifictd style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>sealing filmtd style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;white-space:normal; word-wrap:break-word; wrap-strategy:4;'>Оборудование, используемое для анализа скорости потребления кислорода, старое поколениеtr style='height:19px;'>td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;'>SIGMAtr style='height:19px;'>