Разработка экспериментальной модели аневризмы у кролика с использованием сосуда, обработанного эластаза,

Аннотация

Источник: Wanderer, S., et al. Модель микрохирургической бифуркационной аневризмы артериального мешочка у кролика. J. Vis. Exp. (2020)

В этом видео демонстрируется создание экспериментальной модели аневризмы у кролика с использованием обработанного эластазой сосудистого мешочка. После иссечения сегмента правого ОСА мешочек обрабатывают эластаза, затем пришивают к левому ОСА для восстановления кровотока. Возникающая нагрузка на ослабленные стенки мешка вызывает образование аневризмы.

Протокол

Все процедуры, связанные с моделями животных, были рассмотрены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

ПРИМЕЧАНИЕ: Содержать всех животных при комнатной температуре 22\u201224 по Цельсию (°C) и поддерживать 12-часовой (ч) цикл свет/темнота. Обеспечьте свободный доступ к воде, пеллетам и сенной диете в неограниченном количестве. Статистический анализ проводился с использованием непараметрического критерия Вилкоксона-Манна-Уитни-U. Значение вероятности (p) ≤ 0,05 было признано значимым.

1. Presurgical phase

1. Проведите детальное предоперационное клиническое обследование всех кроликов, запланированных к операции, рядом с тихой, асептической операционной, поддерживая температуру 23 ± 3 °C.
   1. Запишите вес каждого животного макроскопически и оцените слизистые оболочки, время наполнения капилляров и качество пульса.
   2. Далее проведите сердечную аускультацию с помощью стетоскопа и абдоминальную пальпацию.
   3. Основываясь на клинических данных, присвойте каждому кролику классификацию Американского общества анестезиологов (ASA)19. Включайте в исследование только животных с оценкой ASA I.
   4. Побрейте оба наружных уха электробритвой и нанесите крем с прилокаином-лидокаином на обе ушные артерии и вены.
2. Успокойте кролика комбинацией 20 миллиграммов (мг)/килограмм (кг) кетамина, 100 мг/кг дексмедетомидина и 0,3 мг/кг метадона, вводимых подкожно (СК) через шприц.
3. Оставьте каждое животное нетронутым как минимум на 15 минут.
4. После этого, под дополнительным насыщением кислородом 3 литрами (л) / минута (мин) через свободную маску для лица и постоянным мониторингом через пульсоксиметр, поместите канюлю 22 G в левую центральную артерию ушной раковины и еще одну канюлю 22 G в ушную вену контралатерального уха.
5. Побрейте операционное поле (шею) и введите 0,75% периинцизионного ропивакаина внутрикожно. Далее побрейте лоб и подготовьтесь к установке педиатрических электроэнцефалографических (ЭЭГ) датчиков.
6. Вызвать общую анестезию с помощью пропофола 1-2 мг/кг внутривенно (внутривенно) для достижения эффекта. Затем немедленно интубируйте трахею всех кроликов силиконовой трубкой (внутренний диаметр 3 миллиметра (мм)) под капнографическим контролем. После этого перевезите всех кроликов в операционную, поместите их в лежачее положение на спине и подключите трубку к педиатрической системе кругов.
7. Добейтесь углубления и поддержания анестезии с помощью изофлурана в кислороде, нацеливаясь на максимальную концентрацию изофлурана в конце выдоха 1,3%.
8. Обеспечьте клинический и инструментальный мониторинг (пульсоксиметрия, допплерография и инвазивное артериальное давление, электрокардиограмма в 3 отведениях, ЭЭГ, ректальный мониторинг температуры, а также вдыхаемые и выдыхаемые газы) до экстубации трахеи.
9. Для поддержания гидратации лактат Рингера обеспечивается непрерывной инфузией (CRI) со скоростью 5 мл/кг/ч через венозный доступ. Всегда подтверждайте правильную анестезию с помощью щипков на пальцах ног с интервалом в 10 минут.
10. Продезинфицируйте операционное поле с помощью повидон-йода от manubrium sterni до обоих углов челюсти. Теперь проведите стерильную драпировку операционного поля.
11. Во время операции обеспечьте обезболивание лидокаином при CRI 50 микрограмм (μг)/кг/мин и фентанилом со скоростью 3\u201210 μг/кг/ч. Применяйте спонтанную или вспомогательную вентиляцию легких, а также разрешающую гиперкапнию. Проведите анализ газов артериальной крови хотя бы один раз во время операции.
12. Лечите соответствующую гипотензию (среднее артериальное давление < 60 мм рт.ст.) норадреналином. Предотвратите гипотермию (ректальную температуру ≤ 38 °C) с помощью грелки или системы подогрева принудительным воздухом.

2. Хирургическая фаза – шаг I

1. Начните операцию со срединного разреза кожи от грудины до уровня углов челюсти/гортани. Резко рассеките кожу и мягкие ткани скальпелем, хирургическими ножницами и щипцами. Отделите подкожный слой и жировой пакет медиально тупым рассечением.
2. Войдите в передний верхний гребень грудино-ключично-сосцевидной мышцы медиально с левой стороны путем тупого рассечения с помощью микрощипцов и хирургических ножниц.
3. Макроскопически выполните тупое препарирование и осторожно отделите левый CCA от блуждающего нерва дистально, чтобы избежать парезов гортани, используя в дальнейшем микрощипцы и хирургические ножницы (Рисунок 1). Отметим, что разветвление левого ОСА служит интраоперационным ориентиром (Рисунок 2 и Рисунок 3А). Для всех последующих этапов используйте разбрасыватель мягких тканей для улучшения хирургической визуализации.
4. После успешного приготовления и освобождения левого дистального отдела CCA из блуждающего нерва, введите папаверин (40 мг/мл, 1:1, разведенный в 0,9% изотоническом растворе натрия хлорида) местно. Непрерывно защищайте все сегменты сосудов с помощью микротампонов с последующим дальнейшим введением папаверина извне. Поместите пропитанную папаверином левую ОСА ниже аутологичной мышечной ткани, чтобы защитить сосуд от высыхания под светом операционного микроскопа.
5. Поменяйте сторону, максимизируя комфорт хирурга во время операции. Повторите ту же хирургическую процедуру с правой стороны. Рассекайте ОСА дистально и проксимально до заданных ориентиров (бифуркация сонной артерии на уровне углов челюсти/гортани и внутренней яремной вены; Рисунок 3А, В). Снова вставьте разбрасыватель и введите микротампоны и папаверин, как описано ранее.
6. Перед лигированием правого проксимального отдела ОСА введите гепарин (500 международных единиц (МЕ)/кг) системно через венозный ушной катетер.
7. Используйте хирургический микроскоп с этого момента. Во-первых, перевязайте правый проксимальный отдел ОСА нерассасывающимся швом 4-0 непосредственно в конце макроскопически видимого проксимального ориентира, чтобы избежать любого напряжения артериального сосуда.
   1. Во-вторых, нанесите нерассасывающуюся лигатуру 6-0 ровно на 4\u20125 мм дистально, используя зажим для сосуда для измерения, учитывая, что после разрезания дистально от первой лигатуры 4-0 полученный артериальный мешочек будет иметь стандартизированную длину около 3\u20124 мм у каждого животного (рис. 4A,C).
8. После затягивания лигатуры 6-0 зажмите правый CCA как можно дальше с помощью временного зажима для сосудов (как обычно используется при хирургии аневризмы головного мозга), чтобы избежать повреждения эндотелия и создать длинный сегмент сосуда для орошения с целью предотвращения тромбогенеза (Рисунок 4B).
9. Теперь выполните разрез дистально до нерассасывающейся лигатуры 4-0. Чтобы извлечь артериальный мешок (Рисунок 4C), выполните второй разрез дистально до нерассасывающейся лигатуры 6-0.
10. Тщательно очистите артериальный мешочек от всех мягких тканей и измерьте его длину, ширину и глубину (рис. 4C) с помощью зажима для сосудов. Если дальнейшая модификация не требуется, следует хранить аутологичный артериальный трансплантат в гепаринизированном растворе (500 МЕ/100 мл в 0,9% изотоническом хлориде натрия) при комнатной температуре до дальнейшего использования.

3. Деградация артериального мешка

1. Если требуется деградация артериального мешка, тщательно очистите его от мягких тканей и предварительно инкубируйте со 100 МЕ свиной эластазы, растворенной в 5 мл Трис-буфера при комнатной температуре, в день эксперимента в течение 20 минут. Не используйте технику кисти. Инкубируйте артериальный мешочек интра- и экстралюминально с помощью шейкера.
2. Прежде чем поместить мешочек в гепаринизированный раствор 0,9% изотонического натрия хлорида, осторожно проведите им три раза в течение 3 минут анатомическими щипцами в 0,9% изотоническом растворе натрия хлорида, чтобы вымыть оставшуюся свиную эластазу.
3. При необходимости держите просвет артериального мешка открытым с помощью микротрубки из силикона; тщательно защищайте левый и правый CCA во время всей хирургической процедуры с помощью влажных микронабивок.

4. Хирургическая фаза – Шаг II

<

1. span style='background-color:transparent;color:#1a202c;'>Для дальнейшей подготовки CCA поместите два круглых микротампона прямо под ним, чтобы переместить артерию более поверхностно. Теперь поместите один микротампон с фиолетовой прокладкой под левый CCA в дистальной трети для лучшей визуализации артерии.
2. Промойте правый проксимальный CCA раствором 0,9% изотонического натрия хлорида в сочетании с 500 МЕ гепарина, растворенного в 100 мл 0,9% изотонического натрия хлорида. Чтобы создать анастомоз без натяжения, поместите правый CCA под жировой пакет/перитрахеальную мускулатуру, используя хирургические ножницы, чтобы проложить ее в левую сторону. Удалите мягкие ткани артерии.
   1. Теперь сделайте разрез рыбьего рта диаметром 2 мм на проксимальной стороне правого CCA с помощью микроножниц и щипцов.
3. Измените сторону на операционном столе. Зафиксируйте левый дистальный отдел ОСА другим временным зажимом для сосуда, а затем проксимальный левый ОСА с двумя временными зажимами для сосудов. Защитите все открытые сегменты сосудов от высыхания под воздействием хирургического света с помощью влажных микротампонов.
4. Полностью освободите дистальную треть левого CCA от мягких тканей и проведите артериотомию. С помощью хирургических микрощипцов аккуратно захватите мягкие ткани. Теперь поднимите артерию и медленно разрежьте левый дистальный отдел CCA хирургическим микроножом. Промыть сегменты сосудов гепарином (500 МЕ растворить в 100 мл 0,9% изотонического раствора натрия хлорида).
5. После выполнения артериотомии с помощью изогнутых микрощипцов и микроножниц увеличьте артериотомию, расположенную в дистальной трети левой CCA, примерно в 2 раза больше диаметра правой тупой сонной артерии и аутологичного трансплантата. Это обеспечивает достаточный приток крови в артериальный мешочек.
6. Извлеките артериальный мешок из гепаринизированного физиологического раствора. Поместите стомный мешок в операционное поле, где планируется бифуркация. Начните накладывать швы на заднюю часть правой тупой сонной артерии каудально расположенным нерассасывающимся швом 9-0, затем накладывайте шов на краниально расположенную заднюю сторону на уровне разреза во рту рыбы. Завершите прострочивание задней части от дистального к проксимальному одним стежком.
7. Во время наложения швов держите все предварительно инкубированные пакеты с эластазой влажными с помощью непрерывного полива. Во время наложения швов на стенку сосуда стомного мешка используйте изогнутые хирургические микрощипцы, чтобы аккуратно открыть просвет его кончиком. При наложении швов на части левого или проксимального отдела правой ОСА используйте прямые хирургические микрощипцы. После этого зашить горизонтальную тыльную сторону.
8. Затем сшиваем горизонтальную переднюю сторону, начиная с купола аневризмы и двигаясь к его основанию. После этого начните с одиночных стежков дистально на лицевой стороне, двигаясь каудально.
   1. Для всех шагов 4.5\u20124.8 при наложении швов на анастомоз обратите внимание только на то, чтобы захватить часть сосуда, расположенную близко к артериотомии, чтобы избежать ятрогенного стеноза. Кроме того, непрерывно увлажняйте все сегменты сосудов в течение всей хирургической процедуры экстралюминально с помощью шприца, наполненного раствором гепаринизированного натрия хлорида (500 МЕ растворены в 100 мл 0,9% изотонического натрия хлорида) и защищайте их влажными микротампонами.
   2. Перед окончанием анастомоза орошите весь комплекс гепаринизированным 0,9% изотоническим раствором натрия хлорида внутрипросветным путем (500 МЕ, растворенных в 100 мл 0,9% изотонического натрия хлорида). Имейте в виду, что артериальные мешочки, модифицированные эластаза, должны быть пришиты как можно быстрее из-за их сильной склонности к высыханию и тромбообразованию. Из-за агрессивного поведения остаточной концентрации эластазы в мешочном мешке в отношении переваривания кольцевых сосудов, быстро проведите операцию по быстрой повторной перфузии сосудистого комплекса.
9. Снимаем все временные сосудистые зажимы ступенчато.
   1. Снимите дистальный зажим с левого CCA. Примите незначительное кровотечение и остановите его, аккуратно нанеся микромазки на анастомоз. После этого снимите зажим правого CCA, аккуратно надавите микротампоном и щипцами, чтобы избежать образования тромбов.
   2. При необходимости замените временные сосудистые зажимы, чтобы обеспечить достаточную коагуляцию. После этого освободите оба зажима для сосудов с левой стороны проксимально. При необходимости на каком-либо этапе замените зажимы, чтобы обеспечить коагуляцию или выполнить повторное наложение швов.
10. На этом этапе выполните флуоресцентную ангиографию сосудистого комплекса (Рисунок 5)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентная ангиография выполняется путем введения 1 мл флуоресцеина IV, с использованием 2 полосовых фильтров, смартфона с видеокамерой и велосипедного прожектора. Эта процедура уже была описана в другом месте20,21,22.
11. Наконец, закройте оперативный сайт. Приспособьте и аккуратно зашите жировую подушку рассасывающимся швом 3-0 с отдельными узлами для защиты анастомоза. Таким же образом сожмите подкожный слой и кожу.

5. Postsurgical phase

1. Прекратите введение изофлурана и системной анальгезии в конце операции и обеспечьте экстубацию трахеи, как только восстановится глотательный рефлекс.
2. Введите 0,5 мг/кг мелоксикама IV, 10 мг/кг аспирина (ASS) внутривенно, 100 μг витамина B12 SC и 20 мг/кг кламоксила внутривенно.
3. Обеспечьте дополнительное насыщение кислородом и активное согревание до тех пор, пока кролики спонтанно не обретут лежачее состояние грудины.
4. Выполняйте послеоперационное наблюдение и уход за животными четыре раза в день в течение первых трех дней в соответствии с рекомендациями по оценке и лечению боли у грызунов и кроликов23,24.
5. Вводите послеоперационную анальгезию с помощью фентанилового пластыря (12 мкг/ч), нанесенного на наружное ухо, мелоксикама один раз в день СК в течение трех дней и метадона в качестве спасательной терапии СК, согласно протоколу оценки боли. Вводите 250 МЕ/кг низкомолекулярного гепарина (ЛМГ) подкожно в течение трех дней всем кроликам.

Результаты

Рисунок 1: Начальный оперативный шаг.

Начальный оперативный этап, изображающий левую сонную артерию (белая стрелка), блуждающий нерв (черная стрелка) (A) и тщательное отделение левой сонной артерии от блуждающего нерва дистально во избежание парезов гортани.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
3-0 резорбируемый шовный материал	Ethicon Inc., США	VCP428G
4-0 нерассасывающийся шовный материал	B. Braun, Германия	G0762563
6-0 нерассасывающийся шовный материал	B. Braun, Германия	C0766070
9-0 нерассасывающийся шовный материал	B. Braun, Германия	G1111140 <
Amino AG	1445419	any generic
Amiodarone	Helvepharm AG	5078567	любой дженерик
Анестезиологический аппарат	Dräger		любой другой
Aspirin	Sanofi-Aventis (Suisse) SA	622693	любой общий
Atropine	Labatec Pharma SA	6577083	любой generic
Полосовой фильтр синий	Thorlabs	FD1B	любой другой
Полосовой фильтр зеленый	Thorlabs	FGV9	любой другой
Биполярные щипцы			любой другой
Велосипедный прожектор			любой другой
Зажим для сосудов Бимера (2 x)	B. Braun Medical AG, Aesculap, Швейцария	FD560R	temporary
Биспектральный индекс (неонатальный)			любой другой
Манжета для измерения артериального давления (неонатальный)			любой другой
Clamoxyl	GlaxoSmithKline AG	758808	любой generic
Dexmedetomidine	Ever Pharma	136740-1	any generic
Электроды			любые другие
Elastase	Sigma Aldrich	45125	any generic
Ephedrine	Amino AG	1435734	любой общий
Esmolol	OrPha Swiss GmbH	3284044	любой generic
Фентанил (внутривенное использование)	Janssen-Cilag AG	98683	any generic
Фентанил (трансдермальный)	Mepha Pharma AG	4008286	любой общий
Fluoresceine	Curatis AG	5030376	any generic
Fragmin	Pfizer PFE Switzerland GmbH	1906725	any generic
Glyco			any generic
Грелка			any other
Isotonic sodium chloride solution (0.9%)	Fresenius KABI	336769	any generic
Ketamine	Pfizer	342261	any generic
Лабораторный шейкер	Stuart	SRT6	любой другой
Lidocaine	Streuli Pharma AG	747466	any generic
Longuettes			any other
Metacam	Boehringer Ingelheim	P7626406	any generic
Methadone	Streuli Pharma AG	1084546	любой общий
Микротрубки			любые другие
Микродержатель			любой другой
Midazolam	Accord Healthcare AG	7752484	любой generic
Иглодержатель			любой другой
O2-Маска			любая другая
Operation microscope	Wild Heerbrugg		any other
Papaverine	Bichsel		any generic
Prilocaine-lidocaine crème Emla			any generic
Propofol	B. Braun Medical AG, Швейцария		любой дженерик<
		любой дженерик<
		любой другой
Ropivacaine	Aspen Pharma Schweiz GmbH	1882249	любой общий
Скальпель	Swann-Morton	210	любой другой
Маленькая бритва			любой другой
Смартфон			любой другой
Щипцы для мягких тканей			любой другой
Разбрасыватель			любой другой
Миски			любой другой
Стерильные микротампоны			любой другой
Стетоскоп			любой другой
Прямые и изогнутые микрощипцы			любые другие
Прямые и изогнутые микро-ножницы			любые другие
Прямые и изогнутые щипцы			любые другие
Хирургическая простыня			любой другой
Хирургические ножницы			любой другой
Шприцы 1 мл, 2мл и 5 мл			любой другой
Tris-Buffer	Sigma Aldrich	93302	любой generic
Аппликатор для сосудистых зажимов	B. Braun, Германия	FT495T
Vein and arterial catheter 22 G			any generic
Vitarubin	Streuli Pharma AG	6847559	any generic
Yasargil titan standard clip (2 x)	B. Braun Medical AG, Эскулап, Швейцария	FT242T	временный

td style='height:14.5pt;'>Adrenaline электрокардиограммы игл для лица td style='height:15.75pt;'>Пульсоксиметрtd style='height:15.75pt;'>Ректальный датчик температуры (неонатальный) для животных мягких тканей губки из нержавеющей стали