Импедансные измерения инвазии раковых клеток головного мозга

Аннотация

Источник: Mudduluru, G., et. al. Измерение миграции и инвазии раковых клеток в реальном времени на основе импеданса. J. Vis. Exp. (2020)

Это видео демонстрирует импедансный анализ для измерения инвазии и миграции клеток глиобластомы. Клетки разрушают внеклеточный матрикс, перемещаются через микропористые мембраны и прилипают к электродам, генерируя импеданс. Этот анализ в режиме реального времени отражает их инвазивный потенциал для исследований рака.

Протокол

1. Подготовка системы анализа клеток в реальном времени, планшетов для инвазии и миграции клеток (CIM) и электропорированных клеток U-118MG для осаждения{{}}

1. Поместите систему анализа клеток в реальном времени в инкубатор CO₂} в условиях культивирования за 5–6 часов до Начало эксперимента по стабилизации системы к условиям культивирования.
2. Для инвазионного анализа в каждую лунку верхней камеры планшета с инвазией помещают 50 μл DMEM (обычная среда), содержащую гель внеклеточного матрикса (ECM) в концентрации 0,1 μг/μл. Чтобы избежать образования пузырьков воздуха, используйте метод обратного пипетирования. Немедленно удалите 30 μL геля ECM, оставив 20 μL в лунке.
3. После нанесения гелевого покрытия ЭХМ планшет следует подержать в инкубаторе в условиях культивирования в течение 4 ч с закрытой крышкой. Во время нанесения гелевого покрытия и сушки ЭХМ принимайте профилактические меры, чтобы избежать прямого контакта электродов верхней камеры пластин с руками, поверхностями бокса биобезопасности или инкубатором CO₂.
4. Чтобы настроить программу измерения импеданса, дважды щелкните соответствующий значок программного обеспечения (см. Таблица материалов), чтобы открыть приложение системного программного обеспечения (блок управления). Каждая люлька имеет индивидуальное окно с различными вкладками для установки условий эксперимента, временного интервала и продолжительности измерения импеданса, а также анализа данных.
5. На вкладке Layout} установите четырехступенчатые лунки для каждого биологического состояния и установите двухступенчатые измерения импеданса ячейки на вкладке Schedule. Первый шаг — это однократное базовое измерение (один развертка с интервалом в 1 минуту), а второй шаг — измерение импеданса клеток в соответствующих отдельных подставках для реального эксперимента. Для миграции используйте 145 взмахов с интервалом 10 минут, а для инвазии 577 взмахов с интервалом 10 минут, индивидуально заданных) в соответствующих отдельных колыбелях.
6. За час до начала измерения импеданса ячейки добавьте 160 мкл DMEM с 10% FBS в качестве хемоаттрактанта в лунки нижней камеры пластины. Соберите либо верхнюю камеру, содержащую лунки с гелевым покрытием ECM, либо лунки без покрытия с нижней камерой для измерения инвазии и миграции соответственно.
7. Заполните лунки в верхней камере 50 мкл среды с низким содержанием сыворотки и поместите их в подставку системы. Проверьте, все ли скважины распознаются блоком управления, нажав на вкладку Message. Если сообщение отображается как OK, то планшет в люльке готов к эксперименту.
8. {{}}Предварительно инкубируйте полностью упакованные планшеты в инкубаторе в условиях культивирования за 1 ч до измерений в подставке системы анализа клеток в реальном времени, что необходимо для акклиматизации упакованного планшета к условиям культивирования клеток.
9. Для сбора клеток, обработанных средой с низким содержанием сыворотки, промойте клетки, растущие в культуральных чашках, 1x PBS и добавьте 2 мл 0,05% трипсина-ЭДТА (этилендиаминтетрауксусной кислоты). Поместите в инкубатор на 30 с и удалите трипсин-ЭДТА. Соберите клетки в с низким содержанием сыворотки в пробирку объемом 15 мл и подсчитайте клетки с помощью портативного автоматического счетчика клеток.
10. После подсчета центрифугируйте ячейки при давлении 100 x g в течение 5 минут и выбросьте надосадочную жидкость.
11. Ресуспендируйте 800 000 клеток в 800 мкл среды с низким содержанием сыворотки для анализов миграции и инвазии. Кроме того, ресуспендируйте 300 000 клеток в 2 мл питательной среды и семян в 35-миллиметровой чашке для анализа вестерн-блоттинга, чтобы подтвердить регулируемый нокдаун Crk и CrkL.

2. Исходное чтение, посев клеток, и измерение и визуализация импеданса ячейки

1. }Измерьте базовое показание, нажав кнопку подставки Пуск{. Исходный уровень следует считывать после предварительной инкубации планшетов в течение 1 ч в подставке системы анализа клеток в реальном времени в условиях культивирования в инкубаторе с углекислым газом и перед посевом клеток в соответствующие лунки в верхней камере.
   ПРИМЕЧАНИЕ:} Как только будет нажата кнопка , блок управления спросит, следует ли сохранить экспериментальный файл. После сохранения файла анализатор базовой станции измеряет базовый импеданс ячейки, установленный в программе изначально, и переходит в режим паузы до тех пор, пока кнопка Start} будет снова нажата для измерения импеданса ячейки на втором шаге.
2. Выньте обе пластины для миграции и инвазии из подставок после базового измерения и храните их в шкафу биобезопасности.
3. Засейте 100 мкл клеток (100 000 клеток) в четыре раза для каждого биологического состояния в верхней камере планшета CIM в соответствующих лунках, как это запрограммировано в блоке управления люльки с помощью обратного пипетирования, чтобы избежать образования пузырьков воздуха.
4. После посева подержите пластину под шкафом биобезопасности в течение 30 минут при комнатной температуре, чтобы клетки могли равномерно расположиться на дно. Перенесите пластину обратно в соответствующую подставку и нажмите кнопку запуска подставки, чтобы начать измерение импеданса ячейки, как запрограммировано на втором шаге 1.5.
5. После последнего сканирования эксперимент завершается, а результаты сохраняются автоматически.
6. На вкладке Анализ данных} визуализируйте изменения импеданса ячейки в виде индекса ячейки в зависимости от времени во время или после завершения эксперимента. Каждое из соответствующих условий квадрупликат может быть визуализировано либо по отдельности, либо в виде средних и/или стандартных отклонений, щелкнув поля Options} для среднего и стандартного отклонения.
7. Чтобы экспортировать данные индекса ячеек в файл таблицы, откройте пустой файл таблицы, поместите курсор в центр окна ) и щелкните правой кнопкой мыши. В появившемся диалоговом окне выберите опцию Копировать данные в формат списка и вставьте данные в открытую таблицу.
8. Отрегулируйте время в необработанных данных, чтобы оно представляло фактическое время начала измерения импеданса ячейки. Время начала второго шага устанавливается равным нулю.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Блок управления имеет возможность получить индекс ячейки с нормализацией или без нее (т.е. нормализованный индекс ячейки) и визуализировать результаты в виде графического представления в зависимости от времени. В этом примере данные индекса ячеек экспортируются без нормализации для обработки и графического представления.
9. Завершите эксперимент, нажав кнопку Release} в каждой подставке.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
ThermoFisher Scientific	1300 Series Class II, Type A2
CIM plates	Подразделение анализа клеток Agilent Technologies, Inc	5665825001	Пластины
Модифицированная среда орла Дульбекко (DMEM)	ATCC	302002	Культуральная среда, используемая для клетки culture
Фосфатно-солевой буфер Дульбекко (DPBS)	Gibco	21-031-CV	DPBS используется для промывания клеток
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	Hyclone	SH30910.03
Инкубатор углекислого газа Heracell VIOS 160i	ThermoFisher Scientific	51030285	Инкубатор
Matrigel	BD Bioscience	354234	Гель
программное обеспечение RTCA	Подразделение анализа клеток компании Agilent Technologies, Inc		Инструмент, используемый для эксперимента
Scepter	Millipore	C85360	Портативный автоматический счетчик
Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054
U-118MG	ATCC	ATCC HTB15	Клеточные линии, используемые для экспериментов
xCELLigence RTCA DP	Подразделение анализа клеток Agilent Technologies, Inc	380601050

<td style='height:14.5pt;width:153pt;'>Biosafety cabinet для инвазии и миграции клеток углекислого газа внеклеточного матрикса сот