Разработка модели трансламинарного давления с использованием трансламинарной автономной системы

Abstract

Источник: Sharma, T. P., et al., Модель трансламинарной автономной системы для модуляции внутриглазного и внутричерепного давления в задних сегментах донора человека. J. Vis. Exp. (2020).

В этом видео демонстрируется процедура подготовки человеческого глаза к изучению влияния трансламинарного давления на передачу сигналов ганглиозных клеток сетчатки путем моделирования внутриглазного и внутричерепного давления в трансламинарной автономной системе.

Protocol

Все процедуры по сбору проб были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.

1. Подготовка и стерилизация оборудования и расходных материалов

1. Обратитесь к Таблица материалов для получения полного перечня необходимых расходных материалов, а также номеров поставщиков и каталожных номеров.
2. Перед использованием стерилизуйте все оборудование и инструменты путем автоклавирования или с помощью ампул с окисью этилена.

2. Приготовление перфузионной среды

1. Добавьте 1% пенициллин-стрептомицин (10 000 ЕД/мл пенициллина, 10 000 мкг/мл стрептомицина в 0,85% NaCl) и 1% L-глутамина (200 мМ) до 1 000 мл модифицированной среды Дульбекко (DMEM) с высоким содержанием глюкозы.
2. Перфузионную среду стерилизовать, пропустив через фильтр 0,22 мкм.

3. Настройка трансламинарной автономной системы (TAS)

1. Установите входные шприцы (резервуары для внутриглазного давления (ВГД) и внутричерепного давления (ВЧД)).
   1. Добавьте 30 мл перфузионной среды (секция 2) в шприц объемом 30 мл. Прикрепите к шприцу объемом 30 мл 3-позиционный запорный кран. Подсоедините гидрофильный фильтр 0,22 мкм к 3-ходовому запорному крану. Подсоедините адаптер Люэра 15 Г к гидрофильному фильтру 0,22 мкм.
   2. Удалите пузырьки воздуха из установки шприца. Подсоедините трубку к адаптеру 15 G Luer. Закройте боковое отверстие запорного крана невентилируемой универсальной стопорной крышкой. Повторите в общей сложности два подхода.
   3. Обозначьте один шприц как канал 1 внутричерепного давления (CH1 ICP), а другой шприц как канал 2 внутриглазного давления (CH2 IOP).
2. Установите выпускные шприцы (резервуары ВГД и ВЧД).
   1. Прикрепите 3-ходовой запорный кран к шприцу объемом 30 мл. Прикрепите адаптер 15 G Luer к 3-позиционному запорному крану. Подсоедините трубку к адаптеру 15 G Luer.
   2. Закройте боковое отверстие запорного крана невентилируемой универсальной стопорной крышкой. Повторите в общей сложности два подхода. Обозначьте один шприц как CH1 ICP, а другой шприц как CH2 IOP.

4. Подготовка всего глазного яблока человека

ПРИМЕЧАНИЕ: Если получен целый глаз, следуйте приведенной ниже процедуре, чтобы отделить передний сегмент от заднего сегмента глаза. Если глаза получены пополам, начните с шага 4.4.

1. Поместите целый глаз в раствор повидон-йода на 2 мин.
2. Промойте глаз в стерильном фосфатно-буферном растворе (PBS), чтобы удалить повидон-йод. Повторите два раза.
3. Удалите придаток со всего глазного яблока с помощью щипцов и ножниц. Рассеките глаз пополам на экваторе, чтобы разделить передний и задний сегменты глаза.
4. Снимите оболочку зрительного нерва. Удалите стекловидное тело из заднего сегмента.
5. При необходимости обрежьте дополнительные склеры с заднего сегмента, чтобы обеспечить хорошее прилегание к круглому куполу камеры ВГД (дно). С помощью щипцов следите за тем, чтобы сетчатка была равномерно распределена по задней части сегмента.
6. Установка камеры ВГД (нижней
   1. Поместите задний сегмент человека в камеру ВГД (нижней) ТАС над круглым куполом зрительным нервом вверху.
   2. Загерметизируйте задний сегмент с помощью уплотнительного кольца из эпоксидной смолы с четырьмя винтами, обеспечивая плотное прилегание.
   3. Вставьте трубку во входной и выходной порты камеры IOP (нижней). Входной шприц ВГД с трубкой, содержащей среду, вставляется в порт IN, а пустой шприц для отвода ВГД с трубкой вставляется в порт OUT.
   4. Используйте метод «тяни/толкай», чтобы медленно вводить перфузионную среду во входной порт, чтобы заполнить заднюю наглазницу, одновременно медленно вытягивая перфузионную среду через выпускной шприц, чтобы удалить любые пузырьки воздуха из трубопроводов. Прекратите настаивание среды, как только на входной и выходной трубках не будет пузырьков воздуха.
   5. Зафиксируйте запорные краны в выключенном положении. Извлеките шприц объемом 30 мл из фильтра порта IOP IN в сборе и снова наполните его 30 мл среды. Затем замените шприц фильтром в сборе.
7. Установка камеры ВЧД (верхняя)
   1. Поместите камеру/крышку ВЧД (верхнюю) на заднюю часть заднего сегмента. Убедитесь, что зрительный нерв находится в верхней камере. Загерметизируйте верхнюю камеру четырьмя винтами.
   2. Вставьте трубку во входной и выходной порты камеры ICP (верхней). Входной шприц ICP с трубкой, содержащей среду, вставляется в порт IN, а пустой выходной шприц ICP с трубкой вставляется в порт OUT.
   3. Аккуратно и медленно влейте среду во входной порт, чтобы заполнить камеру ICP и удалить пузырьки воздуха из трубопроводов методом push/pull. Прекратите ввод среды, как только в камере ICP и трубках IN и OUT не будет пузырьков воздуха.
   4. Зафиксируйте запорные краны в выключенном положении. Извлеките шприц объемом 30 мл из ИСП в узле фильтра порта и снова наполните его 30 мл среды. Затем замените шприц фильтром в сборе.

Materials