Это видео демонстрирует анализ для изучения фагоцитарной способности микроглиеподобных клеток с использованием pH-чувствительных флуоресцентных синаптосом, меченных красителями.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Анализ фагоцитоза живых клеток микроглиеподобных клеток с использованием синаптосом человека
953 просмотров
⸱
28 апреля 2025 г.
В этой статье
Аннотация
Протокол
- Анализ фагоцитоза живых клеток
- Планшет 20-30 × 104 PMP в 96-луночные планшеты в 100 μл полной среды iMG и следовать процессу дифференцировки в течение 10 дней.
- В день анализа приготовьте раствор для ядерного окрашивания, добавив 1 каплю ядерного красителя для живых клеток в 2 мл базальной среды iMG.
- Удалите 40 μL среды на лунку 96-луночного планшета и добавьте 10 μL раствора ядерного окрашивания с помощью многоканальной пипетки. Инкубируйте планшет при 37 °C и 5%CO2 в течение 2 часов.
- Разморозьте помеченные синаптосомы на льду и аккуратно обрабатывайте ультразвуком с помощью водного ультразвука в течение 1 мин. Немедленно перенесите синаптосомы обратно на лед. Разбавляют меченые синаптосомы в полной среде iMG в соотношении 1 мкл синаптосом на 50 мкл среды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация синаптосомы зависит от анализа и может потребовать оптимизации. Для поддержания относительно низкого процента (т.е. 0,1% или менее) ДМСО в среде рекомендуется не добавлять более 2 мкл синаптосом на лунку. - В качестве отрицательного контроля, предварительно обработайте некоторые лунки цитохалазином D, чтобы ингибировать полимеризацию актина и, таким образом, фагоцитоз. Приготовьте раствор 60 мкМ цитохалазина D в полной среде iMG. Добавьте 10 мкл этого раствора в каждую лунку до конечной концентрации 10 мкМ и инкубируйте при 37 °C и 5%CO2 в течение 30 мин.
- Выньте тарелку из инкубатора и инкубируйте при температуре 10 °C в течение 10 мин. Держите тарелку на льду и добавьте 50 мкл среды, содержащей синаптосомы.
- Центрифугируйте пластину при 270 × g в течение 3 минут при 10 °C и удерживайте пластину на льду до получения изображения.
- Получение и анализ изображений
- Вставьте пластину в считыватель изображений живых клеток и выберите лунки для анализа.
- Выберите объектив с 20-кратным увеличением.
- Отрегулируйте фокус, интенсивность светодиодов (LED), время интеграции и усиление светлого поля и синего (4',6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]) каналов. Флуоресценция синаптосомы должна быть пренебрежимо малой в начальный момент времени. Используйте канал светлого поля в качестве эталона для фокусировки на красном канале (RFP). Время интеграции и выигрыш могут варьироваться в зависимости от эксперимента; используйте эти начальные настройки для красного канала: светодиод: 4, время интеграции: 250 и усиление: 5.
- Выберите количество отдельных плиток, которые должны быть получены в монтаже для каждой скважины (например, получите 16 плиток в центре скважины, тем самым визуализируя примерно 5% от общей площади скважины). Установите температуру 37 °C и желаемый временной интервал для визуализации.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании изображения собирались каждые 1 - 2 часа в течение 16 часов.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Материалы клеточной культуры | < | ||
| Primaria 96-well Clear Flat Flat Bottom Microplate | Corn; vertical-align:bottom; '>353872< | ||
| STEMCELL Technology | 77004 | Относится к ламинину 521 | |
| Компоненты iMG base media | < | ||
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | Итоговая концентрация 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | Итоговая концентрация 1x |
| N2 дополнение, 100x | Gibco | 17502-048 | Конечная концентрация 1x |
| Пенициллин-стрептомицин (10,000 Ед/мл) | Gibco | 15140122< | |
| Компоненты iMG complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Конечная концентрация 55 μM |
| IL-34 | PeproTech или Biologend | 200-34 или 577904 | Конечная концентрация 100 нг/мл |
| iMG base media | Конечная концентрация 1x | ||
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | Конечная концентрация 5 нг/мл |
| TGF-β | PeproTech | 100-21 | Конечная концентрация 50 нг/мл |
| Анализ на фагоцитоз красителей | |||
| NucBlue Live Ready reagent | Invitrogen | R37605 | |
| pHrodo Red, сукцинимидиловый эфир | ThermoFisher Scientific | P36600 | Относится к pH-чувствительному красителю |
| Другие реагенты клеточной культуры | < | ||
| Cytochalasin D | Sigma | < | |
| Software and Equipment | < | ||
| Centrifuge | Eppendorf | Model 5810R | < |
| Biotek | |||
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | Biotek | версия 3.03 |
