Обнаружение фосфорилированного нейронального калий-хлоридного котранспортера 2 с помощью вестерн-блоттинга

Аннотация

Источник: Josiah, S. S., et al. Изучение функций и активности нейронального K-Cl ко-транспортера KCC2 с помощью вестерн-блоттинга. J. vis. exp. (2022).

В видео показаны этапы обнаружения и количественного определения фосфорилированного белка хлоридного калий-котранспортера 2 (KCC2) в лизате клетки. Этот процесс включает в себя иммунопреципитацию для выделения фосфорилированного KCC2 и хемилюминесценцию для количественного определения выделенного белка.

Протокол

1. Клеточная культура и трансфекция

1. Нагрейте все реагенты в ванне с шариками (37 °C) перед процедурой культивирования клеток. Приготовьте питательную среду, модифицированную среду Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 1% 2 мМ L-глутамина, 100x заменимой аминокислоты, 100 мМ пирувата натрия и 100 ЕД/мл пенициллин-стрептомицина.
2. Размораживание стабильно трансфицированной крысы KCC2b человеческих эмбриональных почек 293 клеток (HEK293^rnKCC2b) полностью в ванне с шариками (37 °C). Перенесите клетки из криовиальной пробирки в центрифужную пробирку, содержащую 5 мл свежей среды. Вращаем ячейку при 1200 ×g в течение 3-5 минут.
3. Используйте аспирационную пипетку (прикрепленную к вакуумному насосу) для аспирации надосадочной жидкости и добавьте 10 мл свежей среды для повторного суспендирования клеток. Переложите клеточную суспензию на тарелку диаметром 10 см.
4. Поместите блюдо в инкубатор и дайте ему расти в течение 48 часов при температуре 37 °С во влажной атмосфере 5%_CO2. Следите за инкубационным периодом, чтобы обеспечить здоровый рост клеток. Далее разделите клетки, когда они достигнут более 90% слияния после инкубационного периода.
5. Отсадите старую среду из чашки для клеток и аккуратно промойте клетки 2 мл фосфатного буферного раствора (PBS). Добавьте 2 мл трипсина и выдерживайте около 1-2 минут при комнатной температуре.
6. Используйте 2 мл готовой среды, чтобы аккуратно промыть трипсинизированные клетки в чашке. Добавляйте 9 мл свежей среды в новую посуду и добавляйте по 1 мл раствора из старой посуды в каждую из новых. Перенесите чашки с разделенными клетками обратно в инкубатор на 48 часов, чтобы достичь ≥ 90% конфлюенции.
7. Обработайте клетки либо диметилсульфоксидом (ДМСО) в качестве контроля, либо 8 мкМ ставроспорином, либо 0,5 мМ N-этилмалеимидом (NEM) в течение 15 минут перед сбором клеток в буфере для лизиса.

2. Подготовка клеточных лизатов и загрузка образцов

1. Аспирация среды на чашке для культуры (от процедур трансфекции). Поместите культуру клеток на лед и промойте клетки ледяным PBS.
2. Аспирируйте PBS, затем добавьте 1,0 мл ледяного лизисного буфера, содержащего 50 мМ трис-HCl (pH 7,5), 1 мМ этиленгликоль-бис(β-аминоэтиловый эфир)-N,N,N',N'-тетрауксусную кислоту (EGTA), 1 мМ этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА), 50 мМ фторида натрия, 5 мМ пирофосфата натрия, 10 мМ натрия-β-глицерофосфата, 1 мМ ортованадата натрия, 1% (по объему) Triton X-100, 0,27 М сахарозы, 1 мМ бензамина, 0,1% (v/v) 2-меркаптоэтанола и 2 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF) в чашку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Объем буфера для лизиса во время сбора клеток варьируется в зависимости от размера чашки, например, 1 мл буфера для лизиса подходит на 1 x 10⁷ клеток/100 мм чашку/150 см² колбы, в то время как 0,5 мл подходит на 5 x 10⁶ клеток/60 мм чашку/75 см² колбы.
3. Используйте холодный пластиковый скребок, чтобы соскоблить клетки со дна чашки, затем осторожно используйте пипетку, чтобы перенести клеточную суспензию в микроцентрифужную пробирку, уже находящуюся на льду. Постоянно перемешивайте пробирку в течение 30 минут при температуре 4 °C.
4. Вращайте лизаты клеток в холодной центрифуге (4 °C) при температуре 16 000 x g в течение 20 минут, аккуратно выньте пробирку из центрифуги и поместите ее на лед. Соберите надосадочную жидкость в предварительно охлажденную свежую пробирку и выбросьте гранулы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Может потребоваться варьировать силу и время центрифугирования в зависимости от типа ячейки. Тем не менее, общие рекомендации рекомендуют центрифугирование при 16 000 x g в течение 20 минут. Однако это необходимо определять для каждого эксперимента. Например, такие чувствительные клетки, как лейкоциты, нуждаются в очень низкой скорости центрифугирования.

3. Приготовление иммунопреципитантов из клеточных лизатов

1. Пипетка 300 μL белка-G-сефарозы в микроцентрифужную пробирку. Вращайте раствор при 500 х г в течение 2 минут и выбросьте надосадочную жидкость.
2. Добавьте 500 μL PBS и хорошо перемешайте раствор. Вращайте раствор при 500 х г в течение 2 минут и выбросьте надосадочную жидкость. Повторите этот шаг.
3. Смешайте 1 мг антител против KCC2 Thr906 и анти-KCC2 Thr1007 с 200 μл белка G-сефарозы и составьте объем до 500 μL с PBS. Встряхните на вибрационной платформе или вращающемся колесе в течение 2 часов при 4 °C. Промойте 2 раза PBS.
4. Проведите количественное определение белка на всех клеточных лизатах и добавьте 1 мг клеточного лизата к промытым гранулам. Аккуратно инкубируйте в ротаторе «конец в конец» в течение 2 ч при температуре 4 °C. Открутите шарики и промойте их 3 раза PBS, содержащим 150 мМ хлорида натрия (NaCl).
5. Промойте иммунопреципитанты (шарики) 3x с 200 μL PBS. Ресуспендируйте последнюю гранулу в 100 мкл 1x буфера для проб додецилсульфата лития (LDS).
6. Встряхните пробирки в роторном шейкере при комнатной температуре в течение 5 минут и инкубируйте их в нагревательном блоке при температуре 75 °C в течение 10 минут. Центрифугируйте загружаемый образец при 11 000 x g в течение 2 минут и используйте надосадочную жидкость для загрузки геля.

4. Выполнение вестерн-блот

1. Соберите литейный аппарат и налейте свежеприготовленный 8% разделительный гель (см. Таблицу 1 для рецепта/приготовления), чтобы отлить гель, оставляя около 2 см пространства от верхней части литейного стекла. Добавьте в установку 200 μл абсолютного изопропанола и дайте ей постоять при комнатной температуре в течение 60 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рецепт полиакриламидного геля для электрофореза в виде додецилсульфата натрия и полиакриламида (SDS-PAGE) зависит от размера интересующего белка (Таблица 2). Следовательно, обратите внимание на размер белка, прежде чем определять желаемый процент геля.
2. Используйте пипетку, чтобы удалить изопропанол, и тщательно промойте гель примерно 200 μл дистиллированной воды. Добавьте свежеприготовленный 6% гель для укладки (см. Таблицу 1 для рецепта/приготовления), чтобы заполнить примерно 2 см пространства на отливочной установке. Аккуратно уложите в лунку расческу и дайте постоять при комнатной температуре 30 минут.
3. Закрепите отлитый гель в баке для электрофореза.
4. Растворите 30,3 г основания Tris, 144,1 г глицина и 10 г SDS в 1000 мл дистиллированной воды, чтобы приготовить 10-кратный буфер для переноса. Приготовьте 1x рабочий буфер, добавив 10 мл 10% SDS и 100 мл 10x буфера для переноса в 890 мл дистиллированной воды.
5. Залейте 1x работающий буфер в бак. Загрузите 5 μл маркера молекулярной массы в первую лунку и равное количество белка в каждую лунку геля SDS-PAGE (от 18 до 30 μл, в зависимости от используемого размера гребня). Заполните пустые лунки 1x LDS и запустите гель в течение 90-120 минут при напряжении 120 В.
6. Растворите 58,2 г основания Tris и 29,3 г глицина в 1000 мл дистиллированной воды, чтобы приготовить 10-кратный буфер для переноса. Активируйте нитроцеллюлозную мембрану с помощью 1x трансферного буфера, содержащего 20% метанола. Промойте гель и мембрану с помощью буфера для переноса и аккуратно разложите их по готовящейся стопке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости регулировать pH работающих и передающих буферов, так как они должны быть на оптимальном требуемом pH. Кроме того, желательно подготовить эти буферы и хранить их при комнатной температуре до начала эксперимента, чтобы сэкономить время.
7. Расположите переносимый бутерброд в следующем порядке: отрицательный электрод (черная рамка/конец) - пена для сэндвича - фильтровальная бумага - промытый гель SDS-PAGE - промытая нитроцеллюлозная мембрана - фильтровальная бумага - пена для сэндвича - положительный электрод (красная рамка). Сложите собранный сэндвич в передаточный бак и включите напряжение 90 В в течение 90 минут или 30 В в течение 360 минут.

5. Окрашивание антителами и проявление изображений

1. Снимите мембрану и дайте ей высохнуть. Заблокируйте мембрану на 1 час при комнатной температуре с помощью блокирующего буфера, изготовленного из 5% обезжиренного молока в трис-буферном физрастворе, содержащем 0,1% 1x Tween 20 (1x TBS-T).
2. Инкубируйте мембраны с соответствующими разведениями первичного антитела^8,15,19 и бета-актина (контроль нагрузки) в блокирующем буфере в течение 1 часа при комнатной температуре или в течение ночи при 4 °C. Промойте мембрану в три промывки по 1x TBS-T в течение 5 минут каждое.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубация отдельной мембраны с элементами контроля нагрузки, такими как бета-актин, альфа-тубулин или антитела к глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназе, должна нормализовать другие результаты западного блоттинга во время последующей количественной оценки. Рекомендуемое разведение для каждого первичного антитела доступно в руководстве производителя.
3. Инкубируйте промытую мембрану с вторичным антителом, разведенным в 5000 раз, в блокирующем буфере в течение 60 минут при комнатной температуре. Снова промойте мембрану 3x в 1x TBS-T в течение 5 минут каждая.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется, чтобы вторичное антитело было поднято против того вида, у которого получено первичное антитело. Например, если первичным антителом к общему KCC2 является мышиный анти-KCC2, то необходимо использовать вторичное антитело против мыши.
4. Поместите промытую мембрану на плату изображения. Смешайте равные объемы каждого реагента с усиленной хемилюминесценцией (ECL) и аккуратно распределите смешанный раствор по мембране для выработки сигналов.

6. Получение изображения с помощью системы визуализации и количественного анализа данных

1. Переместите плату изображения в соответствующее отделение системы визуализации для визуализации. Откройте программное обеспечение для обработки изображений на компьютере для обработки изображений.
2. На панели инструментов нажмите «Новый протокол» и выберите «Один канал». Нажмите «Выбрать» в диалоговом окне «Визуализация геля/нанесение», прокрутите до пункта «Блоттинг» и выберите «Химическая высокая чувствительность» или «Химическое высокое разрешение». Затем нажмите на Signal Accumulation Setup, чтобы установить продолжительность и количество получаемых изображений.
3. Нажмите Position Gel в настройках протокола и при необходимости отрегулируйте гель в системе визуализации. Нажмите Run Protocol (Запустить протокол), чтобы получить изображения.
4. Щелкните правой кнопкой мыши одно из полученных изображений под окном каталога изображений, чтобы сохранить изображения на компьютере. Перейдите к нужному изображению и нажмите «Выбрать изображение» и «Продолжить» в диалоговом окне «Выполнить».
5. Нажмите на иконку преобразования изображения, чтобы настроить контрастность и насыщенность пикселей изображения. Нажмите на значок «Скриншот» на общей панели инструментов, чтобы сохранить изображение на компьютер в зависимости от желаемого формата изображения.
6. Измерьте плотность полос с помощью программного обеспечения ImageJ и проанализируйте с помощью соответствующих статистических инструментов.

Результаты

Таблица 1: Рецепт приготовления смеси полиакриламидных гелей (разделение и укладка гелевых растворов).

8 мл 8% разделительного г...<td style='background-color:white;border:1.0pt сплошной черный;padding:3.75pt 2.25pt;width:175.9pt;' colspan='2'>

Материалы