$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.
1. Количественная оценка сомы ганглиозных клеток сетчатки
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура предназначена для количественного определения ром RGC, основанной на иммуногистохимическом окрашивании плоских массивов сетчатки антителом против белка 3A (Brn3a), специфичного для мозга гомеобокса/домена POU.
- Перенесите изолированную сетчатку в 24-луночный культуральный планшет (по одной сетчатке на лунку), содержащий 1 мл 1x PBS, и держите внутреннюю сетчатку обращенной вверх.
- Промывайте ткань 3 раза в течение 10 минут неионогенным поверхностно-активным веществом 0,5%, разведенным в 1x PBS (0,3 мл). Затем осторожно встряхните ткань в 5% бычьем сывороточном альбумине (BSA) в неионогенном поверхностно-активном веществе 2% и 1x PBS (блокирующий раствор; 0,25 мл) в течение 60 минут при комнатной температуре.
- На этапе 1.2 приготовьте раствор первичного антитела Brn3a, разбавив 1:200 в неионогенном поверхностно-активном веществе 0,5% и 1x PBS плюс 5% BSA, и храните его при температуре 4 °C.
- После 60 мин блокировки тканей инкубируйте сетчатку в 0,2 мл раствора первичного антитела при 4 °C в течение 72 ч с легким встряхиванием.
- Промойте ткань 3 раза в течение 10 минут с помощью 1x PBS, затем инкубируйте ткань в течение 2 часов при комнатной температуре в 0,2 мл раствора вторичного антитела, разведенного 1:750 в 1x PBS плюс 5% BSA.
- Далее инкубируют ткань в течение 10 мин в ядерном растворе противокрасителя для окрашивания флуоресцентных ядер. Завершите иммуногистохимическое исследование заключительным этапом промывания 1x PBS (0,3 мл), повторенным 3x.
- Перенесите сетчатку с помощью двух маленьких кистей на предметные стекла для стеклянного микроскопа, сохраняя стекловидную сторону вверх. Расположите дорсальный квадрант сетчатки вверх на предметных стеклах микроскопа. Сделайте еще два радиальных разреза по направлению к диску зрительного нерва, чтобы разграничить остальные 3 квадранта (носовой, вентральный и височный).
ПРИМЕЧАНИЕ: Размеры разреза не фиксированы. Они не должны быть слишком короткими, что препятствует эффективному уплощению сетчатки на предметном стекле, и не должны быть слишком длинными, чтобы они достигали отверстия зрительного нерва и полностью отделяли отграниченный сектор сетчатки от остальной ткани. - Наконец, нанесите 0,2 мл антивыцветающего монтажного средства на стеклянную покровную крышку и поместите ее на плоскую сетчатку для микроскопического анализа тканей. Чтобы оценить плотность RGC, исследуйте плоские крепления под конфокальным эпифлуоресцентным микроскопом с объективом 40x/1.3.
- Для каждого квадранта сетчатки сделайте восемь фотографий: две из центральной сетчатки (~0,9 мм от диска зрительного нерва), три из средней части сетчатки (~2,0 мм от диска зрительного нерва) и три из периферической сетчатки (~3,7 мм от диска зрительного нерва), всего 32 фотографии на сетчатку. Используйте программное обеспечение FIJI для подсчета Brn3a-положительных клеток и оценки средней плотности клеток.