Количественная оценка сомах ганглиозных клеток сетчатки после глазной гипертензии, вызванной прижиганием

Аннотация

Источник: Lani-Louzada, R., et al. Полное прижигание лимбального сосудистого сплетения при хирургически индуцированной глаукоме у грызунов. J. Vis. Exp. (2022).

В этом видео демонстрируется количественная оценка ганглиозных клеток сетчатки из химически фиксированной сетчатки крысы, подвергнутой полному круговому прижиганию лимбального сосудистого сплетения. Процесс включает в себя пермеабилизацию, окрашивание антител и ядерное контрокрашивание с последующей визуализацией под эпифлуоресцентным микроскопом для оценки влияния повышенного внутриглазного давления на жизнеспособность ганглиозных клеток сетчатки.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.

1. Количественная оценка сомы ганглиозных клеток сетчатки

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура предназначена для количественного определения ром RGC, основанной на иммуногистохимическом окрашивании плоских массивов сетчатки антителом против белка 3A (Brn3a), специфичного для мозга гомеобокса/домена POU.

1. Перенесите изолированную сетчатку в 24-луночный культуральный планшет (по одной сетчатке на лунку), содержащий 1 мл 1x PBS, и держите внутреннюю сетчатку обращенной вверх.
2. Промывайте ткань 3 раза в течение 10 минут неионогенным поверхностно-активным веществом 0,5%, разведенным в 1x PBS (0,3 мл). Затем осторожно встряхните ткань в 5% бычьем сывороточном альбумине (BSA) в неионогенном поверхностно-активном веществе 2% и 1x PBS (блокирующий раствор; 0,25 мл) в течение 60 минут при комнатной температуре.
3. На этапе 1.2 приготовьте раствор первичного антитела Brn3a, разбавив 1:200 в неионогенном поверхностно-активном веществе 0,5% и 1x PBS плюс 5% BSA, и храните его при температуре 4 °C.
4. После 60 мин блокировки тканей инкубируйте сетчатку в 0,2 мл раствора первичного антитела при 4 °C в течение 72 ч с легким встряхиванием.
5. Промойте ткань 3 раза в течение 10 минут с помощью 1x PBS, затем инкубируйте ткань в течение 2 часов при комнатной температуре в 0,2 мл раствора вторичного антитела, разведенного 1:750 в 1x PBS плюс 5% BSA.
6. Далее инкубируют ткань в течение 10 мин в ядерном растворе противокрасителя для окрашивания флуоресцентных ядер. Завершите иммуногистохимическое исследование заключительным этапом промывания 1x PBS (0,3 мл), повторенным 3x.
7. Перенесите сетчатку с помощью двух маленьких кистей на предметные стекла для стеклянного микроскопа, сохраняя стекловидную сторону вверх. Расположите дорсальный квадрант сетчатки вверх на предметных стеклах микроскопа. Сделайте еще два радиальных разреза по направлению к диску зрительного нерва, чтобы разграничить остальные 3 квадранта (носовой, вентральный и височный).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Размеры разреза не фиксированы. Они не должны быть слишком короткими, что препятствует эффективному уплощению сетчатки на предметном стекле, и не должны быть слишком длинными, чтобы они достигали отверстия зрительного нерва и полностью отделяли отграниченный сектор сетчатки от остальной ткани.
8. Наконец, нанесите 0,2 мл антивыцветающего монтажного средства на стеклянную покровную крышку и поместите ее на плоскую сетчатку для микроскопического анализа тканей. Чтобы оценить плотность RGC, исследуйте плоские крепления под конфокальным эпифлуоресцентным микроскопом с объективом 40x/1.3.
9. Для каждого квадранта сетчатки сделайте восемь фотографий: две из центральной сетчатки (~0,9 мм от диска зрительного нерва), три из средней части сетчатки (~2,0 мм от диска зрительного нерва) и три из периферической сетчатки (~3,7 мм от диска зрительного нерва), всего 32 фотографии на сетчатку. Используйте программное обеспечение FIJI для подсчета Brn3a-положительных клеток и оценки средней плотности клеток.

Материалы

style='border-left-style:none;border-top-style:none;width:323pt;'>Конфокальная эпифлуоресценция microscope

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Dako North America	S3023	Antifade mounting medium
LSM 510 Meta	Carl Zeiss<
Моноклональная мышь IgG1 anti-Brn3a	MilliporeSigma	MAB-1585	Brn3a первичный раствор
TO-PRO-3	Thermo Fisher Scientific	T3605	Far red-fluorescent nuclear counterstain; излучение на длине волны 661 нм
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9036-19-5	Non-ion-surfactant
IgG-ослиное антитело против мыши + Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	A31570	Вторичный раствор
DAPI	Thermo Fisher Scientific	28718-90-3	diamidino-2-phenylindole; синее флуоресцентное ядерное противопятно; излучение при 452±3 нм

<td style='border-top-style:none;height:15.5pt;width:171pt;'>DAKOtd style='border-left-style:none;border-top-style:none;width:113pt;'>-антитела антител