В видеоролике демонстрируется методика ex vivo для стимуляции внутрисердечной нервной системы для оценки восприимчивости сердца к аритмии. С помощью перфузионного аппарата изолированное сердце мыши перфузируется кислородосодержащим буфером. Затем внутрисердечная нервная система стимулируется с высокой частотой, чтобы вызвать аритмии.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Стимуляция внутрисердечной нервной системы для оценки предрасположенности к аритмии
794 просмотров
⸱
28 апреля 2025 г.
В этой статье
Аннотация
Протокол
Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.
1. Подготовка аппарата Лангендорфа
ПРИМЕЧАНИЕ: Используется коммерчески доступная перфузионная система Лангендорфа.
- Готовят модифицированный раствор Кребса-Хенселеита (119 мМ хлорида натрия, 25 мМ гидрокарбоната натрия, 4,6 мМ хлорида калия, 1,2 мМ одноосновного фосфата калия, 1,1 мМ сульфата магния, 2,5 мМ хлорида кальция, 8,3 мМ глюкозы и 2 мМ пирувата натрия). Чтобы предотвратить выпадение кальция, добавьте в перфузионный раствор смесь 95% кислорода/5% углекислого газа. Отфильтруйте буфер с размером пор 0,22 мкм.
- Добавьте в буфер фармакологическое средство, чтобы исследовать его влияние на электрофизиологию сердца и аритмогенез по мере необходимости.
- Запустите водяную баню и поместите в нее перфузионный раствор, включающий в себя смесь 95% кислорода/5% углекислого газа. Отрегулируйте температуру водяной бани так, чтобы температура перфузионного раствора непосредственно перед канюлей составляла ~37 °C.
- Как только будет достигнута правильная температура, запустите роликовый насос и наполните аппарат раствором для перфузии.
- Отрегулируйте скорость насоса перед установкой сердца, чтобы при установке на аппарат в канюле не осталось пузырьков воздуха.
2. Аппаратная и программная подготовка
- Подключите цифровую систему сбора данных и соответствующее программное обеспечение к аппарату Лангендорфа для непрерывной регистрации перфузионного давления, скорости потока и частоты сердечных сокращений.
- Установите целевое перфузионное давление в общих настройках на 80 мм рт.ст.
- Начните запись.
- Для записи данных и стимуляции с помощью специального цифрового генератора стимулов используйте электрофизиологический катетер с платиновыми электродами, поверхностью электрода 0,5 x 0,5 мм и расстоянием между электродами 0,5 мм.
- Поместите катетер близко к области, где будет расположено сердце после подключения к аппарату.
- Подготовьте стимуляцию, выбрав 2 электрода из катетера и используя продолжительность цикла 100 мс.
3. Приготовление сердца
- } Добавьте холодный (~2 - 4 °C) буфер для перфузии (10 - 20 мл и 40 - 50 мл, чтобы вся чашка была покрыта) в 2 чашки Петри (диаметром 6 см и 10 см) и чашку с канюлей, и поместите их на лед непосредственно рядом с микроскопом и под ним. Подготовьте двойной узел вокруг канюли.
- Быстро иссекайте сердце после вывиха шейки матки, вскрыв грудную клетку с помощью ножниц Майо и щипцов узкого типа. Затем захватите аорту и полую вену над диафрагмой с помощью лондонских щипцов и иссеките блокаду сердца и легких, разрезав ножницами «Косоглазие» все сосуды и соединительную ткань рядом с позвоночником.
- Перенесите блокаду сердца и легких в первую чашку (диаметром 6 см), наполненную ледяным буфером, и осторожно удалите легкие, не повреждая сердце, с помощью ножниц «Косоглазие» и щипцов Лондона. Затем поместите сердце под микроскоп и осторожно удалите тимус, пищевод и трахею с помощью ножниц Spring и щипцов Dumont SS.
- С помощью пружинных ножниц вырежьте отверстие диаметром 1,5 - 2 мм в верхней части правого предсердия для введения катетера. Прорежьте отверстие в легочной артерии. Затем разрежьте аорту непосредственно под надаортальными ветвями и удалите ткань так, чтобы узел можно было легко прикрепить.
- Сохраните предсердные жировые пакеты, в том числе крупное предсердно расположенное ганглионарное сплетение, вокруг левого предсердия нетронутыми или полностью удалите их путем тщательного рассечения.
- Перенесите сердце в чашку с канюлей и поместите ее под микроскоп. Натяните аорту на канюлю с помощью щипцов Dumont SS и плотно завяжите подготовленный узел вокруг аорты. Убедитесь, что канюля не расположена слишком глубоко в аорте, чтобы аортальный клапан и коронарные сосуды оставались свободными.
- Быстро прикрепите канюлю к аппарату Лангендорфа. Убедитесь, что в канюле не осталось пузырьков.
- Измените давление перфузии на 80 мм рт.ст., обеспечив перфузию постоянным давлением.
- Осторожно введите катетер в правое предсердие и правый желудочек, не касаясь и не повреждая сердце, и прикрепите его к канюле с помощью ленты.
- Начните стимуляцию с подготовленной продолжительностью цикла 100 мс в течение начального периода равновесия 20 минут.
- Закройте камеру, чтобы обеспечить стабильную температуру.
4. Электрофизиологические параметры и аритмогенез
- Примените запрограммированную стимуляцию с помощью дистальных или проксимальных электродов катетера при двукратном пороге стимуляции предсердий или желудочков для оценки электрофизиологических параметров, как описано в следующих шагах.
- Определите время восстановления синусового узла как максимальную длину цикла возврата после 10 с кардиостимуляции с фиксированной скоростью при длине цикла S1S1 120 мс, 100 мс и 80 мс.
- Определите точку Венкебаха как самую длинную длину цикла S1S1 (8 стимулов; S1S1: 100 мс; 2 мс ступенчатая редукция) с потерей 11 АВ-узловой проводимости. Определите атриовентрикулярные узловые рефрактерные периоды как самые длинные S1S2 (12 стимулов; S1S1: 120 мс, 110 мс и 100 мс; один короткий сопряженный экстрастимул со ступенчатым снижением S1S2 на 2 мс) с потерей проводимости AV-узлов.
- Определите рефрактерные периоды предсердий и желудочков как самые длинные S1S2 (12 стимулов; S1S1: 120 мс, 110 мс и 100 мс; один короткий сопряженный экстрастимул со ступенчатым снижением S1S2 через 2 мс) с отсутствующим предсердным или желудочковым ответом.
- Для оценки желудочкового аритмогенеза выполните запрограммированную экстрастимуляцию (S1S1: 120 мс, 100 мс и 80 мс, за которыми следует до 3 дополнительных ударов; 60 - 20 мс с ступенчатым сокращением на 2 мс) или протоколы взрывной стимуляции (5 с S1S1: 50 - 10 мс с поэтапным снижением на 10 мс) в соответствии с Ламбетской конвенцией.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Sodium chloride | Модифицированное решение Кребса-Хенлейта | ||
| Sodium hydrogencarbonate | |||
| Potassium chloride | Модифицированное решение Кребса-Хенлейта | ||
| Фосфат калия моноосновный | |||
| Magnesium sulfate heptahydrate< | |||
| Кальция хлорида дигидрат | |||
| Glucose | Модифицированное решение Кребса-Хенлейта | ||
| Пируват натрия bioXtra | |||
| Carbogen (95% кислорода / 5% углекислого газа) | |||
| Стерильный фильтр steritop-GP 0.22 | |||
| Perfusion system | |||
| Система сбора данных и соответствующее программное обеспечение для катетера и физиологических параметров | |||
| Octapolar catheter | |||
| Генератор стимулов | |||
| Stimulation software | |||
| Plastic Wrap | |||
| Пружинные ножницы | |||
| Stramismus Scissors | |||
| Mayo Scissors | |||
| Dumont SS Mentps | |||
| London Mentps | |||
| Narrow Pattern Mentps |
