Индукция легкой черепно-мозговой травмы у мышиной модели

Аннотация

Источник: Macheda, T., et. al. Электромагнитная управляемая модель легкой черепно-мозговой травмы у мышей. J. Vis. Exp. (2022)

Это видео демонстрирует процедуру индуцирования закрытой черепно-мозговой травмы на мышиной модели с использованием стереотаксической рамки. Контролируемое воздействие воспроизводит легкую черепно-мозговую травму, что позволяет исследователям изучать неврологические эффекты и восстановление, измеряя посттравматические рефлексы и поведение.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Хирургическая процедура

1. Закрепите мышь в стереотаксической раме с помощью легких конических ушных планок из ацетальной смолы, прикусочной планки и маски для анестезии мыши (см. Рисунок 1G, H). Газообразный изофлуран доставляется в концентрации 2%-3% в воздух помещения со скоростью 100-200 мл/мин. Внимательно следите за дыханием мыши, чтобы обеспечить глубину анестезии и при необходимости регулируйте уровень газа.
2. Нанесите на глаза стерильную глазную смазку, чтобы предотвратить высыхание роговицы.
3. Трижды простерилизовать кожу головы повидон-йодными тампонами и стерильными спиртовыми салфетками.
4. Убедитесь, что мышь глубоко обезболивается, проверив отсутствие реакции на щипывание пальца ноги.
5. Сделайте скальпелем разрез кожи головы по средней линии между глазами и шеей примерно на 1 см, обнажая череп (см. Рисунок 1I).
6. Дайте черепу высохнуть в течение 1-2 минут.
7. Определите брегму (точку пересечения коронального и сагиттального швов) и лямбду (пересечение сагиттального и лямбдовидного швов) (см. Рисунок 1J).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Атлас мозга мыши может быть использован для справки.
8. Поместите устройство для поддержки головы под голову и надуйте лампу водой до тех пор, пока она не будет прижиматься к нижней части головы мыши, но не отрывать голову от планки для укуса.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходим для уменьшения возможных проблем с ушами из-за закрытой черепно-мозговой травмы (ЦИ). Любое животное с повреждением уха из ушных планок, повлекшим за собой перекатывание или кровотечение, должно быть исключено из исследования и усыплено.
9. Переместите ударный элемент на место над головой животного.
10. Выдвиньте импактор, поместив тумблер Extend/Retract (на блоке управления импактора) на Extend.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно убедитесь, что наконечник полностью вытянут, потянув за наконечник вниз.
11. Выровняйте ударный элемент так, чтобы он оказался по центру брегмы (см. Рисунок 1K).
12. Сбросьте цифровые стереотаксические координаты x и y в стереотаксическом считывателе на 0 (на сенсорном экране)
13. Выровняйте зонд по месту удара, переместив зонд с брегмы на целевые координаты: медиально-латеральный = 0,0 мм, передне-задний = −1,6 мм.
14. Прикрепите контактный датчик к уху животного.
    1. Медленно опустите наконечник щупа с помощью выдвинутого щупа до первого контакта с поверхностью. Остановитесь на звуковом сигнале.
    2. Сбросьте цифровые стереотаксические координаты z в стереотаксическом считывателе на 0.
15. Внимательно осмотрите, находится ли кончик на одном уровне с черепом (медиально-латеральная и передне-задняя плоскости).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Позиционирование наконечника зонда является наиболее важным этапом этого процесса для предотвращения переломов черепа и повреждения ушей.
16. Втяните ударный элемент, поместив тумблер на блоке управления в положение «Втягивание». Наконечник отводится и больше не соприкасается с головой животного до момента удара.
17. Установите глубину удара, отрегулировав дорсально-вентральную глубину до −1,2 мм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Глубина удара влияет на тяжесть травмы. Глубина должна быть титрованной для разного возраста, веса и штаммов мышей до желаемой степени тяжести травмы. Со временем может потребоваться корректировка/изменение титра для поддержания постоянной тяжести травмы. Тяжесть может быть оценена невропатологически: микроглия и астроциты (иммуногистохимия (ИГХ)) и поведенчески: лабиринт с радиальным рукавом воды и тест активного избегания.
18. Внимательно следите за дыханием мыши, чтобы обеспечить глубину анестезии, и при необходимости регулируйте уровень газа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Часто процент изофлурана должен быть снижен или отключен на 10-20 секунд перед ударом. Внимательно следите за тем, чтобы дыхание немного ускорилось. Если дыхание слишком медленное в момент удара, животное может умереть от апноэ в течение первых 60 с после удара. Этого можно избежать, отрегулировав глубину анестезии за секунды до воздействия.
19. Вызовите удар, нажав правый тумблер в положение impact. Наконечник зонда опускается вниз с отображаемой скоростью, а затем остается внизу в течение заданного времени задержки и втягивается.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фиктивные мыши получают такое же обращение, как и мыши CHI, но воздействие не достигается.
20. Запустите таймер сразу после подачи удара CHI для записи времени коррекции (время возврата из бокового положения в положение лежа) или запустите таймер, когда мышь будет удалена из стереотаксической рамки для фиктивных мышей. Среднее время рефлекса выпрямления составляет 5-15 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время рефлекса выпрямления может варьироваться в зависимости от напряжения мыши и возраста.
21. Оцените мышей на предмет видимых переломов черепа, кровоизлияний и апноэ. Исключите из исследования мышей с вдавленным переломом черепа или видимым кровоизлиянием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Существуют дифференцированные уровни переломов черепа. Животных с декомпрессионными переломами черепа, когда кость заметно вдавливается в ткань мозга, усыпляют (сначала CO₂, а в качестве вторичного метода используется обезглавливание). Если наконечник ударного элемента установлен правильно, эти типы переломов черепа встречаются крайне редко. Если перелом черепа все же происходит, более распространенным проявлением является небольшая капля крови на черепе и небольшая тактильная шероховатость черепа, часто вдоль шва, соединяющего задний конец носовой кости. Эти мыши отмечены как возможные переломы черепа в записях, но обычно не исключаются из исследования.
22. Снимите животное со стереотаксической рамки.
23. Закройте кожу головы, скрепив кожу головы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рассасывающиеся или нерассасывающиеся шовные материалы могут быть использованы для закрытия кожи головы в качестве альтернативы скобам.
24. Нанесите на закрытый разрез тройную мазь с антибиотиком стерильным аппликатором с ватным наконечником.
25. Верните мышь в чистую клетку для восстановления. Половина клетки для восстановления находится на грелке (низкая настройка), что обеспечивает возможность отходить от тепла во время бодрствования и поддерживать температуру животного в бессознательном состоянии (см. Рисунок 1L).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мышь кладется на бок в клетку для восстановления. Чтобы предотвратить удушье, поместите животное в клетку для восстановления без подстилки или на салфетку, если в клетке есть подстилка.
26. Верните тумблер Extend/Retract в положение Center/Off .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ток будет продолжаться, если переключатель оставить в положении выдвижения или втягивания, что приведет к разбуханию поршня. В этом случае импактор не будет функционировать до тех пор, пока поршень не остынет.
27. Извлеките ударный элемент из держателя и аккуратно положите его на пакет со льдом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Удержание импактора на пакете со льдом помогает уменьшить потенциальное набухание импактора.
28. Наблюдайте за животным до тех пор, пока не сработает рефлекс выпрямления, и запишите время до выпрямления (см. Рисунок 1M).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рефлекс выпрямления определяется как момент, когда мышь возвращается в положение лежа. Клетку нужно оставлять в покое; Мышь может выпрямиться, если к клетке прикоснуться, переместить или подвергнуть воздействию каких-либо шумов.
29. Возвращайте мышей в их домашнюю клетку, когда они проснутся и будут бдительны. Обычно в течение 1 часа после травмы животные приходят в полное сознание и передвигаются. Кроме того, добавьте немного влажного корма на дно клетки.

Результаты

Рисунок 1: Шаг 1: Настройка операционной области. (A) Показан пример операционной области и инструментов, необходимых для проведения операции ЦИ (пакет со льдом для импактора, стереотаксическая рама, оснащенная импактором, блок управления импактором и хирургические инструменты). (B) Крупный план стального наконечника зонда толщиной 5 мм, пр...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
9 mm Autoclip Applier	Braintree scientific	ACS- APL	Surgery
9 мм Autoclip Remover	Braintree scientific	ACS- RMV	Surgery
9 mm Autoclip, Case of 1,000 clips	Braintree scientific	ACS- CS	Surgery (Staples)
Программное обеспечение Aperio ImageScope	Leica BioSystems	NA	IHC
BladeFLASK Blade Remover	Fisher Scientific	22-444-275	Surgery
Cotton tip applicator	VWR	89031-270	Surgery
Digitial mouse stereotaxic frame	Stoelting	51730D	Surgery
Dumont #7 Щипцы	Roboz	RS-5047	Surgery
Ear bars	Stoelting	51649	Surgery
EthoVision XT 11.0	Noldus Information Technology	NA<
Fiber-Lite	Dolan-Jeffer Industries	UN16103-DG	Surgery
Fisherbrand Bulb for small Pipets	Fisher Scientific	03-448-21	Аппарат
Система избегания Gemini<	NA	Active avoidance
Грелка	Sunbeam	732500000U	Surgery prep
HRP conjugated goat anti-rabbit IgG	Jackson Immuno Research laboratories	111-065-144	IHC
Индукционная камера	Kent Scientific	VetFlo-0530XS	Surgery prep
Isoflurane, USP	Covetrus	NDC: 11695-6777-2	Surgery
Мышиная газообразная анестезиологическая головка holder	Stoelting	51609M	Surgery
Neuropactor Stereotaxic Impactor	Neuroscience Tools	n/a	Surgery: Формально распределено Lecia как impact one
NexGen Mouse 500	Allentown	n/a	После операции, удержание клетки
Parafilm	Bemis	PM992	Аппарат
Peanut - Professional Hair Clipper	Whal	8655-200	Surgery prep
Раствор повидона-йода USP, 10% (w/v), 1% (w/v) доступный йод, для лаборатории<	3955-16	Surgery
Puralube Vet Oinment,pettrolatum ophthalmic мазь, Стерильная глазная смазка	Dechra	17033-211-38	Surgery
Rabbit anti-GFAP	Dako	Z0334	IHC
Rabbit anti-IBA1	Wako	019-19741	IHC
8-рычажный радиальный рукав Водный лабиринт	MazeEngineers	n/a	RAWM
Scale	OHAUS CS series	BAL-101	Подготовка к
Рукоятка скальпеля #7 твердая 6.25"	Roboz	RS-9847	Surgery
Sterile Alcohol Prep Pads (изопропиловый спирт 70% v/v)	Fisher Brand	22-363-750	Surgery prep
Система низкопоточной анестезии SumnoSuite	Kent Scientific	SS-01	Surgery
10 мл шприца Luer-Lok Tip	BD Bard-Parker	302995	Аппарат
Timers	Fisher Scientific	6KED8	Хирургия
Крем для местной анестезии	L.M.X 4	NDC 0496-0882-15	Подготовка к
Мазь с тройным антибиотиком	Major	NDC 0904-0734-31	Post-surgery
Трубка-трубка	MasterFlex	96410-16	Аппарат
Система одноканальной анестезии Vaporizer	Kent Scientific	VetFlo-1210S	Подготовка к операции

td style='width:190pt;'>RAWM поддержки головыtd style='width:149pt;'>San Diego Instruments поддержки головыtd style='width:149pt;'>Ricca операции поддержки головы операции поддержки головы