Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Анализ динамики кальция и изменений мембранного потенциала в эндотелии артериол мыши

746 просмотров

⸱

28 апреля 2025 г.

В этой статье

Аннотация

Источник: Хаким, М. А. et al., Выделение и функциональный анализ артериолярного эндотелия паренхимы мозга мыши. J. Vis. Exp. (2022).

В этом видео демонстрируется функциональный анализ артериолярной эндотелиальной трубки, выделенной из мозга мыши. В нем описаны шаги по измерению внутриклеточных уровней кальция и мембранного потенциала, как на исходном уровне, так и в ответ на фармакологическую стимуляцию.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующими специалистами по этике животных. Ревизионный комитет.

1. Материалы и оборудование

ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите <span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none; vertical-align:baseline; white-space:pre-wrap;'>Таблица материалов для всех реагентов и материалов, необходимых для этого протокола. Кроме того, при необходимости можно ознакомиться с руководствами и веб-сайтами, связанными с соответствующими поставщиками.

  1. Flow chamber
    1. Закрепите камеру суперфузии со стеклянным покровным стеклом на платформе, состоящей из анодированного алюминия. Закрепите платформу с камерой на алюминиевом предметном столике для микроскопа.
    2. NOTE:
    3. Настройте экспериментальную установку, установив перевернутый микроскоп (объективы: 4x, 10x, 20x, 40x и 60x) и ручной алюминиевый столик на виброизоляционном столе.
  2. m записывающее оборудование
    1. Подключите электрометр к совместимому головному устройству. Используйте аксессуары, такие как генератор функций и стимулятор, для протоколов, требующих подачи тока.
    2. 2+] style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none; vertical-align:baseline; white-space:pre-wrap;'>i в эндотелиальных клетках.
    3. NOTE:<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal; font-weight:400;text-decoration:none; vertical-align:baseline; white-space:pre-wrap;'> Экспериментатору понадобится электронный съемник стекла и микрокузница для подготовки к закреплению Пипетки.
      1. Чтобы закрепить эндотелиальную трубку в камере суперфузионного синтеза, приготовьте термополированные пипетки с притупленным сферическим концом (внешний диаметр: 50-70 мкм), приготовленные из тонкостенных капилляров из боросиликатного стекла.
      2. m2. Решения и лекарства

        1. Подготовьте минимум 1 л PSS, используя 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-этанессульфоновая кислота (HEPES) и 10 мМ глюкозы.
        2. 2<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none; vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'> (ноль Ca2+ PSS) для рассечения артериол головного мозга и выделения эндотелиальных Трубы.
          NOTE: Подготовьте все решения в сверхчистом деионизированном H2
        3. Подготовьте запас Fura-2 AM в диметилсульфоксиде (DMSO; 1 мМ). Приготовьте 500 мкл рабочей концентрации (10 мкМ), добавив 5 мкл материала к 495 мкл PSS для загрузки.
        5. Подготовьте 2 M KCl, растворив KCl в деионизированном H2O (7,455 г KCl в 50 мл H2O). Пропустите раствор через шприц с фильтром 0,22 мкм перед заполнением острых электродов.

      3. Использование артериолярных эндотелиальных трубок для исследования клеточной физиологии

      NOTE:2+] style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none; vertical-align:baseline; white-space:pre-wrap;'>i динамика и V<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400; text-decoration:none; vertical-align:baseline; white-space:pre-wrap;'>m используя фотометрию и электрофизиологию острых электродов, соответственно, как показано ранее (Рисунок 1). [Ка2+]i и Vm могут быть измерены как отдельные или комбинированные экспериментальные переменные (Рисунок 1

    4. Measurement of [Ca2+] style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none; vertical-align:baseline; white-space:pre-wrap;'>i
        2+]i записи, сохраняя при этом непрерывную суперфузию со скоростью потока 5-7 мл/ Мин.
      1. 2+Figure 1A2+] style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none; vertical-align:baseline; white-space:pre-wrap;'>i возбуждая Fura-2 попеременно (≥10 Гц) на 340 нм и 380 нм, собирая флуоресцентное излучение на 510 нм. Один раз стабильная базовая запись [Ca2+]i установлено, применять фармакологические средства (например, пуринергический рецептор агонисты) в соответствии с экспериментальной целью (Figure 1B).
    5. m
        mmFigure 1A).

    Однажды эндотелиальный покой Vm стабилен (от −30 до −40 мВ), применяем желаемое фармакологическое агенты по экспериментальной цели (Figure 1C<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none; vertical-align:baseline; white-space:pre-wrap;'>).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

figure-results-1

Рисунок 1: Применение эндотелиальной трубки для физиологического исследования путей, связанных с регуляцией кровотока. (A) Острый электрод (фиолетовая стрелка) расположен в ячейке эндотелиальной трубки, сфокусированной в окне сбора данных для фотометрии. (B) Репрезентативная регистрация внутриклеточного Ca2+ с помощью фотометрии Fura-2 в ответ на MTA (1 мкМ)...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
AmplifiersMolecular Devices, Sunnyvale, CA, СШАAxoclamp 2B & Axoclamp 900A
Звуковые базовые мониторыAmpol US LLC, Сарасота, Флорида, США BM-A-TM
Bath Chiller (Isotemp 500LCU)ThermoFisher Scientific13874647
Капилляры из боросиликатного стекла (штифт)Warner InstrumentsG150T-6
Капилляры из боросиликатного стекла (острые электроды)Warner InstrumentsGC100F-10
BSA: Бычий сывороточный альбуминSigmaA7906
CaCl2: Кальция хлоридSigma223506
DMSO: ДиметилсульфоксидSigmaD8418
Клапан управления потокомWarner Instruments FR-50
Интерфейс флуоресцентной системы, дуговая лампа и источник питания, гиперкоммутатор и молекулярные устройства PMT, Саннивейл, Калифорния, СШАIonOptix Systems
Функциональный генераторEZ Digital, Сеул, Южная КореяFG-8002
Fura-2 AM красительInvitrogen, Карлсбад, Калифорния, СШАF14185
ГлюкозаSigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США)G7021
HCl: Hydroic AcidThermoFisher Scientific (Питтсбург, Пенсильвания, США)A466250
HeadstagesMolecular DevicesHS-2A & HS-9A
HEPES: (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота)SigmaH4034 
Встроенный нагреватель раствораWarner InstrumentsSH-27B
KCl: Хлорид калияSigmaP9541
MgCl2: Хлорид магнияSigmaM2670
MicroforgeNarishige, East Meadow, NY, США MF-900
МикроманипуляторSiskiyou MX10
Съемник микропипеток (цифровой)Sutter Instruments, Новато, Калифорния, СШАP-97 или P-1000
Microscope (Nikon-inverted)Nikon Instruments Inc, Мелвилл, Нью-Йорк, СШАTs2
Nikon Instruments IncEclipse TS100
объективы микроскопаNikon Instruments Inc20X (S-Fluor) и 40X (Plan Fluor)
Платформа микроскопа (анодированный алюминий; диаметр, 7.8 см)Warner InstrumentsPM6 или PH6
Столик для микроскопа (алюминий)Siskiyou, Grants Pass, OR, США8090P
MTA: 2-Метилтиоаденозиндифосфат тринатрия сольTocris1624
NaCl: Sodium ChlorideSigmaS7653
NaOH: Гидроксид натрияSigmaS8045
ОсциллографTektronix, Бивертон, Орегон, США TDS 2024B
Фазово-контрастные объективыNikon Instruments Inc (Ph1 DL; 10X & 20X)
Plexiglas superfusion chamberWarner Instruments, Camden, CT, СШАRC-27
СтереомикроскопыZeiss, NY, СШАStemi 2000 & 2000-C
Шприцевой фильтр (0.22 μm)ThermoFisher Scientific722-2520
Регулятор температуры (двухканальный)Warner InstrumentsTC-344B или C
Система управления клапанамиWarner InstrumentsVC-6
Виброизоляционный столТехническое производство, Пибоди, Массачусетс, США Micro-g
<td style='height:14.5pt;'>Microscope ( Nikon Inverted)

Теги

Мозг мышифлуоресцентный красительвведение электродастимуляция GPCRвнутриклеточный кальцийвыход калияфункциональный анализ
Анализ динамики кальция и изменений мембранного потенциала в эндотелии артериол мыши
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.