Анализ динамики кальция и изменений мембранного потенциала в эндотелии артериол мыши

Abstract

Источник: Хаким, М. А. et al., Выделение и функциональный анализ артериолярного эндотелия паренхимы мозга мыши. J. Vis. Exp. (2022).

В этом видео демонстрируется функциональный анализ артериолярной эндотелиальной трубки, выделенной из мозга мыши. В нем описаны шаги по измерению внутриклеточных уровней кальция и мембранного потенциала, как на исходном уровне, так и в ответ на фармакологическую стимуляцию.

Protocol

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующими специалистами по этике животных. Ревизионный комитет.

1. Материалы и оборудование

ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите <span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none; vertical-align:baseline; white-space:pre-wrap;'>Таблица материалов для всех реагентов и материалов, необходимых для этого протокола. Кроме того, при необходимости можно ознакомиться с руководствами и веб-сайтами, связанными с соответствующими поставщиками.

1. Flow chamber
   1. Закрепите камеру суперфузии со стеклянным покровным стеклом на платформе, состоящей из анодированного алюминия. Закрепите платформу с камерой на алюминиевом предметном столике для микроскопа.
   2. NOTE:
   3. Настройте экспериментальную установку, установив перевернутый микроскоп (объективы: 4x, 10x, 20x, 40x и 60x) и ручной алюминиевый столик на виброизоляционном столе.
2. _m записывающее оборудование
   1. Подключите электрометр к совместимому головному устройству. Используйте аксессуары, такие как генератор функций и стимулятор, для протоколов, требующих подачи тока.
   2. ²⁺] style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none; vertical-align:baseline; white-space:pre-wrap;'>_i в эндотелиальных клетках.
   3. NOTE:<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal; font-weight:400;text-decoration:none; vertical-align:baseline; white-space:pre-wrap;'> Экспериментатору понадобится электронный съемник стекла и микрокузница для подготовки к закреплению Пипетки.
      1. Чтобы закрепить эндотелиальную трубку в камере суперфузионного синтеза, приготовьте термополированные пипетки с притупленным сферическим концом (внешний диаметр: 50-70 мкм), приготовленные из тонкостенных капилляров из боросиликатного стекла.
      2. _m2. Решения и лекарства
         1. Подготовьте минимум 1 л PSS, используя 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-этанессульфоновая кислота (HEPES) и 10 мМ глюкозы.
         2. _2<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none; vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'> (ноль Ca²⁺ PSS) для рассечения артериол головного мозга и выделения эндотелиальных Трубы.
            NOTE: Подготовьте все решения в сверхчистом деионизированном H₂
         3. Подготовьте запас Fura-2 AM в диметилсульфоксиде (DMSO; 1 мМ). Приготовьте 500 мкл рабочей концентрации (10 мкМ), добавив 5 мкл материала к 495 мкл PSS для загрузки.
         5. Подготовьте 2 M KCl, растворив KCl в деионизированном H₂O (7,455 г KCl в 50 мл H₂O). Пропустите раствор через шприц с фильтром 0,22 мкм перед заполнением острых электродов.

      3. Использование артериолярных эндотелиальных трубок для исследования клеточной физиологии

      NOTE:²⁺] style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none; vertical-align:baseline; white-space:pre-wrap;'>_i динамика и V<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400; text-decoration:none; vertical-align:baseline; white-space:pre-wrap;'>_m используя фотометрию и электрофизиологию острых электродов, соответственно, как показано ранее (Рисунок 1). [Ка²⁺]_i и V_m могут быть измерены как отдельные или комбинированные экспериментальные переменные (Рисунок 1

   4. Measurement of [Ca²⁺] style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none; vertical-align:baseline; white-space:pre-wrap;'>_i
      ²⁺]_i записи, сохраняя при этом непрерывную суперфузию со скоростью потока 5-7 мл/ Мин.
      1. ²⁺Figure 1A²⁺] style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none; vertical-align:baseline; white-space:pre-wrap;'>_i возбуждая Fura-2 попеременно (≥10 Гц) на 340 нм и 380 нм, собирая флуоресцентное излучение на 510 нм. Один раз стабильная базовая запись [Ca²⁺]_i установлено, применять фармакологические средства (например, пуринергический рецептор агонисты) в соответствии с экспериментальной целью (Figure 1B).
   5. _m
      _mmFigure 1A).

   Однажды эндотелиальный покой V_m стабилен (от −30 до −40 мВ), применяем желаемое фармакологическое агенты по экспериментальной цели (Figure 1C<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none; vertical-align:baseline; white-space:pre-wrap;'>).

Results

Рисунок 1: Применение эндотелиальной трубки для физиологического исследования путей, связанных с регуляцией кровотока. (A) Острый электрод (фиолетовая стрелка) расположен в ячейке эндотелиальной трубки, сфокусированной в окне сбора данных для фотометрии. (B) Репрезентативная регистрация внутриклеточного Ca²⁺ с помощью фотометрии Fura-2 в ответ на MTA (1 мкМ)...

Materials