Иммуномечение белков нейрональных мембран в сублимационном образце ткани мозга мыши

Аннотация

Источник: Schönherr, S., et. al. Комбинированное оптогенетическое и замораживающее иммуномаркирование реплики для изучения входного специфичного расположения глутаматных рецепторов в миндалевидном теле мыши. J. vis. exp. (2016)

В этом видео демонстрируется иммуномаркировка лихорадочных реплик ткани мозга мыши с помощью электронной микроскопии. Раздробленные и покрытые оболочкой реплики расщепляются для обнажения рецепторов. Первичные и помеченные золотом вторичные антитела добавляются для маркировки специфических рецепторов нейронных мембран. Реплика устанавливается на сетку и визуализируется под электронным микроскопом.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.

1. Подготовка образца

1. Фиксация мозга
   1. Приготовление фиксатора
      1. Для 1 л фиксатора взвесьте 10 г параформальдегида и добавьте его в 300 мл деионизированной воды (H₂O). Нагревайте до 55 - 60 ºC в течение ~10 минут при непрерывном помешивании.
      2. Выключите огонь и добавьте 7-8 капель 4 Н гидроксида натрия (NaOH). Раствор должен стать прозрачным через ~10 минут.
      3. Дайте ему остыть до комнатной температуры или RT, добавьте 150 мл насыщенного раствора пикриновой кислоты и доведите его до 500 мл с помощью деионизированного H₂O.
      4. Добавьте 500 мл 0,2 М фосфатного буфера (PB). Профильтруйте фильтровальной бумагой. Отрегулируйте pH до 7,4 с помощью NaOH.
      5. Охладите фиксатор до 6 ºC и храните его во флаконах из темного стекла не более одного дня при температуре 6 ºC.
   2. }Транскардиальная перфузия
      1. Обезболите мышей внутрибрюшинной инъекцией тиопентала (120 мг/кг массы тела). Убедитесь, что животное глубоко обезболито, проверив рефлекс отвода педали, который должен отсутствовать. Положите животное на спину на перфузионный стол с четырьмя завязанными конечностями.
      2. Раскройте брюшную стенку в продольном направлении ножницами с тупым концом и сделайте два дополнительных разреза в поперечном направлении вдоль каудальной границы грудной клетки, чтобы обнажить диафрагму. Отрежьте диафрагму и разрежьте грудную стенку на костно-хрящевой границе с обеих сторон. Поднимите каудальный конец центральной пластины грудной стенки, содержащей грудину, чтобы обнажить сердце.
      3. Удалите перикард и сделайте небольшой точный надрез на кончике левого желудочка, чтобы впустить канюлю перфузионного аппарата. Используйте тупую канюлю с внутренним диаметром 0,6 мм. Осторожно пропустите канюлю через желудочек до тех пор, пока кончик не появится в восходящую аорту, и закрепите канюлю зажимом. Чтобы кровь и перфузаты вышли из кровотока, сделайте надрез в правом предсердии.
      4. Перфузируйте мышей транскардиально с помощью перистальтического насоса со скоростью потока 5 мл/мин сначала фосфатным буферным раствором или PBS (25 мМ, 0,9% хлорида натрия или NaCl, pH 7,4) в течение примерно 1 мин, а затем охлаждайте фиксатором со льдом в течение 7 мин.
      5. После фиксации отрежьте голову мыши ножницами, а затем разрежьте кожу по средней линии от шеи до носа. Удалите мышцу, чтобы полностью обнажить череп.
      6. С помощью острых ножниц сделайте продольный разрез через затылочную и межтеменную кости, начиная от большого затылочного отверстия. С помощью тонкого пинцета удалите эти косточки, чтобы обнажить весь мозжечок. Затем сделайте еще один продольный надрез через теменную и лобную кости до носовой кости и удалите их пинцетом, чтобы обнажить весь мозг.
      7. С помощью шпателя извлеките мозг, не повреждая его, и поместите его в ледяную температуру 0,1 М ПБ.
2. Секция и обрезка образцов
   1. Разрежьте корональный блок размером примерно 5 - 6 мм бритвенными лезвиями, содержащими интересующую область. Приклейте его на держатель виброслайсера с помощью цианоакрилатного клея. Сориентируйте тканевый блок так, чтобы неокортекс был обращен к вибрирующему лезвию. Разрежьте корональные срезы, содержащие миндалевидное тело с температурой 140 мкм, с помощью виброслайсера (Рисунок 1A) в ледяном 0,1 М PB и соберите их в 6-луночную чашку в том же буфере.
   2. Под стереомикроскопом отрежьте интересующую область (в данном случае медио-дорсальное паракапсульное скопление интеркалированных клеточных масс миндалевидного тела или ITC; см. Рисунок 1B) от среза. Делают это в чашке Петри, покрытой силиконовым эластомером и заполненной 0,1 М ПБ, с помощью офтальмологического скальпеля. Убедитесь, что обрезанные блоки входят в отверстие распорки (примерно на 1,5 мм) (Рисунок 1B).
   3. Переместите обрезанные блоки в криопротекторный раствор (30% глицерин в 0,1 М ПБ) на ночь (O/N) при температуре 6 ºC.

2. Замораживание под высоким давлением

ПРИМЕЧАНИЕ: Иммуномаркировка реплики при замораживании и переломе (FRIL) состоит из 6 основных этапов (Рисунок 2): 1) Быстрая заморозка с высоким давлением (при 2,300 - 2,600 бар) образца. 2) Дробление образца. Плоскость перелома обычно следует за центральным гидрофобным ядром замороженных мембран, разделяя их на две полумембранные створки: половину, которая прилегает к протоплазме (P-face), и половину, которая прилегает к внеклеточному или экзоплазматическому пространству (E-face). 3) Репликация образца методом вакуумного осаждения платины и углерода. 4) Моющее средство-переваривание тканей. 5) Маркировка Immunogold. 6) Анализ реплики с помощью просвечивающего электронного микроскопа.

1. Подготовка медных носителей
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для прохождения последовательных этапов процедуры FRIL образцы необходимо установить на металлические (золотые или медные) носители. Эти носители различаются по размеру и конструкции в зависимости от режима гидроразрыва пласта и типа используемых машин. Здесь мы использовали медные держатели (Рисунок 1B, E) и шарнирный «двойной стол реплики» (см. Рисунок 3B), который при открытии производит разрыв на растяжение через замерзший образец (Рисунок 2). Это позволяет сохранить и воспроизвести обе стороны отломанного образца.
   1. Отполируйте медные носители средством для удаления потускнения с помощью листа замши.
   2. Поместите носители в стеклянную кастрюлю и дважды очистите неионогенным моющим средством (pH ~ 1,5) на водяной бане, затем тщательно промойте в водопроводной воде, затем в деионизированной воде, а затем дважды промойте этанолом.
   3. Обработайте медные носители ультразвуком в ацетоне в течение 15 минут.
   4. Поместите носители на фильтровальную бумагу для высыхания.
   5. Прикрепите кольцо двустороннего скотча к медному носителю (Рисунок 1C), который будет служить колодцем для обрезанного блока (держателем).
2. Замораживание образца
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обращайтесь с жидким азотом осторожно и надевайте соответствующие очки.
   1. Включите морозильную установку высокого давления (Рисунок 1F) не менее чем на 1,5 часа перед замораживанием образца.
   2. Запустите нагрев, нажав кнопку "ВОЗДУШНЫЙ ОБОГРЕВАТЕЛЬ", и выпекайте в течение 50 минут. Установите температуру воздуха на 80 °C.
   3. Подключите баллон с азотом к морозильной установке высокого давления и нажмите кнопку "АЗОТ", чтобы заполнить внутреннюю часть Дьюара жидким азотом. Загорается лампа «УРОВЕНЬ АЗОТА». Запустите охлаждение нажатием кнопки "Охлаждение".
   4. Нажмите кнопку "DRIVE IN", когда индикатор "NITROGEN LEVEL" погаснет. Убедитесь, что гидравлическая система перемещает поршень вперед и назад 3 раза.
   5. Нажмите кнопку "AUTO", и кнопку "NITROGEN". Как только загорится надпись «READY», морозильная установка под высоким давлением готова к заморозке под высоким давлением.
   6. Поместите обрезанный блок в отверстие двустороннего скотча (Рисунок 1B) с помощью петли из платиновой проволоки, которая была расплавлена в стеклянную пипетку.
   7. Удалите излишки раствора криопротектора с помощью фильтровальной бумаги или щетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура также важна для удаления пузырьков воздуха, которые могут образоваться вокруг ткани и которые могут вызвать искажение формы ткани и/или ультраструктуры.
   8. Под стереомикроскопом накройте удерживающий носитель другим носителем, так чтобы тканевый блок оказался зажатым между двумя носителями.
   9. Вставьте несущий сэндвич в держатель образца морозильной установки высокого давления (Рисунок 1D). Вставьте держатель образцов в морозильный узел высокого давления (опрокидите вниз) и закрепите его, вкрутив держатель образцов.
   10. Запустите цикл заморозки, нажав кнопку "Jet-Auto". Работая как можно быстрее, снимите держатель образца и погрузите наконечник с жидким азотом в изолированный ящик. Погрузите кончики двух пар щипцов в жидкий азот, чтобы охладить их.
   11. Осторожно извлеките сэндвич-носитель из держателя образца и поместите его в предварительно охлажденный криовиал. Убедитесь, что носители обрабатываются только щипцами, охлаждаемыми жидким азотом. Криовиалы должны быть перфорированы, чтобы азот мог вытекать из флакона (Рисунок 1G).
   12. Повторяйте шаги с 2.2.6 по 2.2.11 до тех пор, пока все необходимые образцы не будут заморожены. Несколько сэндвичей-носителей, содержащих один и тот же тип образца, могут храниться в одном флаконе.
   13. Храните криовиалы, содержащие носители, в криотанке до репликации (Рисунок 1H).

3. Замораживание и репликация

1. Подготовка электронно-лучевых пушек
   1. Перед установкой электронно-лучевых пушек снимите щит с "дефлекторной пластиной". Поместите «установочный калибр» по центру нити накала в цанговый патрон через нижнюю крышку катода.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Больший диаметр установочного калибра используется для карбонового пистолета, тогда как меньший диаметр - для платинового пистолета.
   2. Наденьте новую нить на манометр до тех пор, пока «пластинки давления» не смогут зажать концы нити, следя за тем, чтобы катушка нити не лежала под углом.
   3. Снимите установочный указатель и вставьте карбоновый стержень. Зафиксируйте его, затянув цанговый патрон держателя стержня испарителя, следя за тем, чтобы высота конца стержня находилась на середине второго змеевика снизу. Для платинового пистолета высота конца платинового стержня должна быть в середине второй катушки накаливания сверху.
   4. Установите на место дефлекторную пластину и вставьте пистолеты в узел замораживания. После использования очистите пистолеты пескоструйной обработкой.
2. Настройка блока замораживания-разрушения
   1. Включите блок замораживания разрушения (Рисунок 3A), повернув MAINS в положение 1. Подробное описание процедур замораживания-разрушения и репликации см. в инструкции по эксплуатации, предоставленной производителем.
   2. Перед охлаждением устройства замораживания-разрушения прогрейте всю систему охлаждения агрегата теплым воздухом. Нажмите кнопку "Размораживание" в устройстве MTC 010 (блок контроля температуры) (Рисунок 3A) и дайте процессу выпекания продолжаться в течение 45 минут.
   3. Активируйте вакуумную станцию. Установка замораживания и разрушения обычно работает в диапазоне вакуума ~10^-6 - 10^-7 мбар.
   4. Заполните резервуар с азотом и подключите его к блоку замораживания. Убедитесь, что держатель клапана сухой, а также очистите вход в бак перед установкой держателя клапана (влажность может мешать вакууму и индикации N₂ наполнения бака).
   5. Начните охлаждение, установив температуру на -115 °C. Охлаждение занимает около 45 минут.
   6. Вставьте электронно-лучевые пушки и отрегулируйте ток и напряжение, чтобы достичь следующих параметров испарения:
      Углеродная пушка: вращение вкл., положение 90°, скорость накопления углерода 0,1 - 0,2 нм/сек
      Углеродно-платиновая пушка: вращение выключено, положение 60°, скорость накопления 0,06 - 0,1 нм/сек
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если пистолет используется впервые после замены углеродного или платинового стержня, дегазируйте его в течение 3 минут перед использованием.

3. Разрыв пласта и репликация

   1. Вставьте замороженные сэндвичи-носители в таблицу двойной реплики, убедившись, что все манипуляции выполняются в жидком азоте.
   2. Перенесите двойную реплику стола в сосуд Дьюара и закрепите его на приемнике ступенчатого столика под углом 45°. Уровень жидкого азота всегда должен быть выше таблицы двойной реплики.
   3. Возьмите двойную реплику стола с манипулятором стола и вставьте его в установку замораживания на холодную сцену. Подождите около 20 минут, чтобы температура стола с двойной репликой стабилизировалась до -115 °C.
   4. Убедитесь, что вакуум ниже 10^-6 мбар и температура -115 °C.
   5. Разломайте ткань путем ручного вращения против часовой стрелки колеса, соединенного с кожухом, расположенным над двойным столом-репликой. Когда кожух поворачивается, он заставляет двойной реплику стола открыться, разрушая ткань.
   6. Нажмите кнопку "Высокое напряжение" в устройстве EVM 030 (блок управления электронно-лучевым испарением) установки замораживания-разрушения (Рисунок 3A).
   7. Воспроизвести открытые поверхности разрушенной ткани (Рисунок 3C) путем испарения углерода (вращение) с помощью электронно-лучевой пушки, расположенной под углом 90° на толщину 5 нм, с последующим однонаправленным затенением платино-углеродом под углом 60° до толщины 2 нм. Наконец, нанесите слой углерода толщиной 15 нм под углом 90° (вращающийся).
   8. Используйте следующие параметры для испарения:
      1-й углерод: вращение вкл, положение 90°; скорость 0,1 - 0,2 нм/сек; 5 нм
      2-й углерод-платина: положение 60°; скорость 0,06 - 0,1 нм/с; 2 нм
      3-й карбон: вращение вкл., положение 90°; скорость 0,3 - 0,5 нм/с; 15 нм
   9. Извлеките реплицированные образцы из установки замораживания и перенесите их на керамическую 12-луночную пластину (Рисунок 4A), заполненную TBS (трис-буферизованным физиологическим раствором, pH 7,4).
   10. С помощью проволочного стержня с платиновой петлей удалите реплицированную ткань из носителя образца (Рисунок 4A).
   11. Повторяйте шаги с 3.3.1 по 3.3.10 до тех пор, пока все образцы не будут воспроизведены.

   4. SDS-разложение реплики

   1. Перенесите реплику в стеклянный флакон объемом 4 мл, наполненный 1 мл буфера для SDS-разложения (2,5% лаурилсульфата натрия, 20% сахарозы в 15 мМ Трис, pH 8,3). Варить в течение 18 часов при температуре 80 °C с встряхиванием (45 ударов/мин).
   2. Перенесите реплики в новую пробирку, заполненную буфером для разложения SDS, и храните в RT.

4. Иммуномаркировка

ПРИМЕЧАНИЕ: Все инкубации проводятся в ЛТ с легким встряхиванием, за исключением инкубации с антителами.

1. Промойте реплику в течение 10 минут в свежем буфере для разложения додецилсульфата натрия (SDS).
2. Промойте реплику один раз 2,5% БСА (бычьим сывороточным альбумином) в трис-буферизованном физрастворе или TBS в течение 5 минут, а затем 3 x 10 минут 0,1% БСА в TBS.
3. Заблокируйте неспецифические сайты связывания в TBS 5% BSA на 1 час.
4. Внесите первичные антитела, разведенные в 2% BSA-TBS. Проводите инкубацию в капле объемом 30 мкл (Рисунок 4B) во влажной камере при 15 °C в течение 72 часов (Рисунок 4C).
   1. Для этого исследования обработайте обе реплики из сломанной ткани. Инкубируют одну реплику с поликлональным антителом морской свинки, выращенным против аминокислот 717 - 754 мышиного GluR1, общих для всех α-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовой кислоты или субъединиц AMPA-R (разведение: 1:200) или мышиного моноклонального антитела, выращенного против рекомбинантного гибридного белка, покрывающего аминокислоты 660 - 811 NR1 субъединицы N-метил-D-аспартатного рецептора или NMDA-R (разведение: 1:500) и кроличье поликлональное антитело, выращенное против зеленого флуоресцентного белка (разведение: 1:300).
   2. Инкубируют другую реплику с кроличьим поликлональным антителом, выращенным против синтетического пептида, соответствующего аминокислотам 384 - 398 μ-опиоидного рецептора крысы (разведение: 1:500).
5. Стирать в TBS с 0,05% BSA (3 x 5 мин.).
6. Применяют вторичные антитела. Для этого исследования использовали золотые (5 нм для ионотропных глутаматных рецепторов, 10 для μ-опиоидных рецепторов и/или 15 нм для желтого флуоресцентного белка Channelrhodopsin-2 или ChR2-YFP), разведенные в TBS с 2% БСА. Разведите вторичные антитела в соотношении 1:30 и инкубируйте в капле объемом 30 мкл при 15 °C O/N.
7. Промойте 3 x 5 минут в 0,05% BSA-TBS на RT.
8. Промойте 2 x 5 минут в ультрачистой воде.
9. Монтируйте реплику на 100-строчную параллельную стержневую сетку с покрытием formvar (Figure 4D).

Результаты

Рисунок 1. Препарирование тканей и замораживание под высоким давлением. (A) Виброслайсер используется для разрезания тканей. (B) Полученный участок мозга корональной мыши, содержащий миндалевидное тело, пок...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Tissue preparation
Paraformaldehyde EM grade	Agar Scientific Ltd., Великобритания<
Насыщенный раствор пикриновой кислоты	Sigma-Aldrich, США	P6744-1GA
Na2HPO4-2H20	Merck Millipore, Германия	1065860500
NaH2PO4-2H2O	Merck Millipore, Германия	1063451000
NaCl	Merck Millipore, Германия<
4N NaOH	Карл Рот, Германия	T198.1
Thiopental	Sandoz, Austria	5,133
Glycerol	Sigma-Aldrich, США	G5516-500ML
Система сверхчистой воды GenPure	Thermo Fisher Scientific, США	50131235
Peristaltic pump	ISMATEC, Германия	ISM 930C
Filter Paper	MACHEREY-NAGEL, Германия<
Vibroslicer, VT1000S	Leica Microsystems, Австрия<
Alcon Laboratories, США
Perfusion canjula	Vieweg, Germany	F560088-1
High-pressure Frizing
Copper carriers	Engineering Office M. Wohlwend, CH	528
Sidol Polish	Henkel, Германия<
Chamois skin	Магазин бытовых товаров	<
Штубай, Австрия
Denatured ethanol	Donauchem, Австрия<
Acetone	Roth, Germany	9372.5
Машина для замораживания под высоким давлением HPM 010	BalTec, CH; теперь Leica Microsystems	HPM010
Stereo-microscope	Olympus, Japan	SZX10
Жидкий азот		<
Roth, Германия	E309.1
CryoCane	Nalge Nunc International,США	5015-0001
CryoSleeve	Nalge Nunc International,США	5016-0001
Резервуар для хранения жидкого азота	Cryopal, Франция	GT38
Неионогенное моющее средство (Lavocid)	Werner & Mertz Professional, Германия<
Freeze-fracture and Replication
Sandblaster, Mikromat 200-1	JOKE Joisten & Kettenbaum, Германия<
Siliciumcarbid SIC 360, размер зерна 25 - 21μ	JOKE Joisten & Kettenbaum, Германия<
Система замораживания BAF 060	BalTec, CH; теперь Leica Microsystems	BAF060
Ceramic 12 well plate	Gröpel, Австрия	14511
Trizma base	SIGMA, США	T1503
Trizma hydrochloride	SIGMA, США	T3253
Sodium chloride	Merck, Germany	1,06,40,41,000
SDS, Sodium laurylsulfate<	5136.1
Sucrose	Merck, Германия<
TRIS	Roth, Германия	5429.3
Универсальная гибридизационная печь<
Immunolabelling
BSA	SIGMA, США<
Anti-GFP Antibody	Molecular Probes, США	A111122
Anti-pan-AMPAR Anti-AMPAR1 Anti-AMPAR1	Frontier Institute, Japan	pan AMPAR-Af580-1
style	MAB363
Opioid Receptor-Mu (MOR) Antibody	ImmunoStar, США	24216
EM козья антиморская свинка, 5nm; вторичное антитело	BBInternational,	EM. GAG5
EM козий анти-кролик, 15nm; вторичное антитело	BBInternational,	EM. GAR15
DAR 10nm		AURION, Netherlands	DAR 10nmtd
Agar scientific, UK	G2012C
Incubatortd	MO-RC
Pioloform Powder	Agar scientific, UK	R1275
Chloroform	Roth, Germany	3313.1

td style='width:153pt;'>AGR1018td style='width:153pt;'>1064041000td style='width:153pt;'>MN 615 1/4td style='width:153pt;'> <td style='height:14.5pt;width:153pt;'>Ophthalmic scalpeltd style='width:153pt;'> td style='height:15.75pt;width:153pt;'>Дырокол, 1,5mmtd style='width:153pt;'> td style='height:15.75pt;width:153pt;'>Cryo-vialstd style='width:153pt;'> td style='width:153pt;'>САНДУРЕТ 2- Ktd style='width:153pt;'>955932td style='width:164pt;'>Roth, Germanytd style='width:153pt;'>1,07,68,71,000td style='width:164pt;'>Binder, Германия<td style='width:153pt;'>7001-0050td style='width:153pt;'>A9647<, Germany style='height:15.75pt;width:153pt;'>Incubator< style='width:164pt;'>Major Наука, США