Одновременная запись плетизмографии и электромиографии на мышиной модели с БАС

Аннотация

Источник: Jensen, V. N., et al. Повторное измерение активности дыхательных мышц и вентиляции на мышиных моделях нервно-мышечных заболеваний. J. Vis. Exp. (2017).

В этом видео демонстрируется метод одновременной записи сигналов плетизмографии и электромиографии в свободно движущейся модели мыши ALS. Процедура включает в себя использование имплантированных электродов и передатчика для захвата мышечной активности, а также плетизмографической камеры для мониторинга дыхания, чтобы исследовать роль вспомогательных мышц у мышей с БАС.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Подготовка мыши к операции

1. Выберите желаемую мышь для имплантации (т.е. SOD1(G93A) или контроль) и взвесьте животное.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемый возраст и вес мыши (самца или самки), проходящей эту операцию, составляет P56 - P120 и ≥ 24 г соответственно.
2. Обезболите мышь под действием 3,5% изофлурана со скоростью потока кислорода 2 л/мин. Выполните сжатие пальцев ног и хвоста, чтобы убедиться, что мышь полностью обезболивается.
3. После обезболивания извлеките мышь из коробки и поддерживайте анестезию через носовой конус, установив уровень изофлурана на 1,5% и скорость потока кислорода на 1 л/мин. Выполните защемление пальца ноги и/или хвоста, чтобы убедиться, что анестезия сохраняется.
4. Нанесите лубрикантическую офтальмологическую мазь, чтобы предотвратить пересыхание глаз во время операции.
5. Побрейте мышь, чтобы обнажить хирургическое место между ухом и плечом (Рисунок 1C).
6. Подстригите ногти на ногах ипсилатерально к месту операции, чтобы уменьшить вероятность того, что мышь выдернет проводники или нанесет раны расчесыванием в процессе заживления.
7. Чередуйте тампон с места операции, сначала дезинфицирующим средством, а затем изопропанолом. Повторите еще 2 раза.

2. Имплантация телеметрического устройства для регистрации активности лестничной и трапециевидной электромиографии (ЭМГ)

1. Поместите животное под диссекционный микроскоп, на бок поверх стерильной прокладки, накрывающей грелку, и закрепите носовой конус на месте лентой. Обратите внимание, что лучше всего имплантировать правую сторону, чтобы уменьшить сигнал электрокардиограммы (ЭКГ), исходящий от сердца.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Контролируйте дыхание и при необходимости регулируйте уровни изофлурана для поддержания регулярной частоты дыхания и соответствующей хирургической плоскости анестезии.
2. Потяните переднюю конечность к ипсилатеральной стопе вдоль туловища.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это положение смещает лопатку каудально, обеспечивая хирургический доступ к лестничным и трапециевидным мышцам.
   1. Возьмите тупые изогнутые щипцы, прижмите переднюю лапу ипсилатерально к месту операции и заклейте лапу скотчем (Рисунок 1C). Используйте прочную клейкую хирургическую ленту, чтобы убедиться, что лапа надежно закреплена на протяжении всей процедуры.
3. Наденьте свежую пару хирургических перчаток. С помощью скальпеля сделайте косой разрез длиной около 2 см между плечом и ухом (красная линия на рисунке Рисунок 1C).
4. Используя два щипца для ламинэктомии #2, по одному в каждой руке, оттяните жировую подушку назад и раздвиньте трапециевидные мышцы и мышцы платизмы, чтобы обнажить фасцию, покрывающую грудино-ключично-сосцевидные и лестничные мышцы (Рисунок 1D и E).
5. Используйте бледную грудино-ключично-сосцевидную мышцу и диафрагмальный нерв в качестве ориентиров для идентификации лестничных мышц. Обратите внимание, что диафрагмальный нерв проходит параллельно лестничным мышцам,, в то время как грудино-ключично-сосцевидный находится ниже. Лестничные мышцы идут косо от шейных позвонков к ребрам под трапециевидной мышцей. Биопотенциальные отведения будут вставлены в переднюю лестничную мышцу, которую можно идентифицировать как мышцу, которая проходит рядом с диафрагмальным нервом (Рисунок 1F и G).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Внимание. Эта область сильно васкуляризирована, и необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать перерезания подключичной артерии. Избегайте повреждения диафрагмального нерва и плечевого сплетения.
6. После того, как лестничные и трапециевидные мышцы были идентифицированы (Рисунок 1G), сделайте подкожный карман для передатчика на спине животного, между лопатками.
   1. Используйте ножницы, разделяющие ткани. Вставьте тупые кончики прямо под кожу и распределите их до тех пор, пока не образуется отверстие в кармане, примерно в 1,25 раза превышающее ширину передатчика (Рисунок 1H).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Передатчик должен быть вставлен с минимальным сопротивлением, но карман не должен быть настолько большим, чтобы передатчик мог перемещаться самостоятельно. Если карман слишком мал, передатчик может тереться о кожу, вызывая раздражение, которое может побудить животное почесать кожу и/или вытащить провод. Если карман слишком большой, могут образоваться серомы, или передатчик может мигрировать в невыгодное положение.
7. Промойте теплым стерильным физиологическим раствором и вставьте трансмиттер более плоской стороной к мышце. Расположите передатчик так, чтобы он лежал ровно, а провода выходили из кармана, параллельно друг другу, а не скрученные (Рисунок 1I). Сверните любой лишний отрезок провода под прибор и уложите его плашмя.
8. Проведите провода от передатчика к лестничной и трапециевидной мышцам так, чтобы два набора бипотенциальных проводов лежали ровно и параллельно друг другу.
9. С помощью щипцов для ламинэктомии отделите переднюю лестничную мышцу от окружающих мышц и введите иглу 25-го калибра перпендикулярно мышечным волокнам через лестничную мышцу.
   1. Вставьте один провод в кончик иглы, а затем вытяните иглу из мышцы, оставив позади провод, вставленный в мышцу, вплоть до изоляции провода (Рисунок 1J и K). Запишите, какие цветные провода в какую мышцу введены.
10. Нанесите небольшую каплю цианоакрилатного клея на открытый конец проволоки, рядом с мышцей, в которую вставлен провод, и быстро наденьте свинцовый колпачок на проволоку так, чтобы между свинцовым колпачком и мышцей не было оголения провода (Рисунок 2A и B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя это общепринятая практика закрепления проводов ЭМГ цианоакрилатом, альтернативным методом является завязывание шелкового шовного узла вокруг свинцового колпачка.
11. Обрежьте лишнюю проволоку дистальнее колпачка и нанесите каплю цианоакрилатного клея на конец свинцового колпачка/проволоки. Дайте клею время полимеризоваться перед тем, как отпустить (Рисунок 2C и D).
12. Выполните те же действия (шаги 3.10-3.12), чтобы ввести провод противоположной полярности параллельно первому в ту же мышцу, на расстоянии 1 - 2 мм от первого провода.
13. Повторите шаги 3.10 - 3.12, чтобы ввести проводники в трапециевидную мышцу, которая расположена прямо перед лестничной мышцей (Рисунки 1L и M).
14. Убедитесь, что провода закреплены на месте и что провисания достаточно, чтобы животное могло выполнять движения тела, не дергая за них. Следите за тем, чтобы излишняя длина поводка не давила на кожу, так как это может вызвать раздражение, которое может побудить животное поцарапать или вытащить поводок. При необходимости измените положение проводов, чтобы предотвратить возможный дискомфорт.
15. Аккуратно снимите ленту, прижимающую переднюю конечность. Подтяните жировую подушку обратно к мышце и с ее помощью накройте вставленные отведения. Закройте разрез цианоакрилатным клеем, дразня кожные лоскуты так, чтобы разрез выровнялся. Зажмите часть кожных лоскутов вместе с изогнутыми щипцами и нанесите по этой линии небольшую линию цианоакрилатного клея.
16. Введите 0,1 мл карпрофена подкожно, чтобы облегчить послеоперационную боль, пока животное еще находится под анестезией.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжайте вводить 0,1 мл карпрофена один раз в день в течение 1-2 дней после операции, а затем по мере необходимости.
17. Извлеките животное из носового конуса и поместите его в чистую клетку в предварительно прогретый инкубатор до тех пор, пока оно не придет в себя и не сможет свободно перемещаться по клетке. После этого подержите животное в инкубаторе не менее 15 минут, следя за его движениями и бдительностью.

3. Послеоперационный уход

1. }Домашние животные отдельно после операции. Обеспечьте целебных животных диетическим гелем и бутылкой с водой.
2. Наблюдайте за животным в течение первых 30 минут после операции. Проверяйте животное не реже одного раза в час в течение 5 часов после операции. В течение нескольких дней после операции проверяйте не реже двух раз в день.
3. Следите за некрозом, инфекцией вдоль разреза и внутри полости тела, содержащей имплантат (т.е. , жар, отек и покраснение) и образованием серомы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти признаки проявляются в течение первой недели после операции. Рисунок 1N показывает здоровое, зажившее животное через месяц после операции. Несмотря на то, что запись ЭМГ может быть сделана сразу после имплантации, животным дается по крайней мере одна неделя на заживление, прежде чем записывать ЭМГ и плетизмографию, так как сигналы ЭКГ могут быть высокими сразу после имплантации.

4. Получение одновременных сигналов электромиографии и плетизмографии

1. Включите все оборудование для сбора данных, включая поток смещения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость потока для мышей обычно устанавливается на уровне 1,0 л/мин.
2. Откалибруйте камеру (камеры) плетизмографии с помощью расходомера.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Периодически проверяйте плетизмографические камеры, чтобы убедиться, что пломбы не треснули или не сломаны. Чтобы поддерживать их в хорошем состоянии, раз в неделю покрывайте резиновые уплотнители смазкой, такой как вакуумная смазка.
3. Калибровка входного передатчика в соответствии с указаниями производителя.
4. Поместите мышь в камеру плетизмографии не менее чем на 1 ч для ее акклиматизации перед записью ЭМГ и плетизмографии. Используя несколько камер, можно вести запись с одной мыши, в то время как следующая мышь акклиматизируется во второй камере. Не включайте передатчик во время периода акклиматизации для экономии заряда батареи (Рисунок 1O).
5. Перед записью (но после калибровки) включите передатчик, поместив сильный магнит в пределах 1 дюйма от имплантированного животного; Красный индикатор на передней панели приемника будет указывать на то, когда передатчик включен.
6. Начните сбор данных с помощью раскрывающегося меню с надписью «Приобретение» и выберите «Начать сбор данных». Хотя продолжительность записи может варьироваться в зависимости от эксперимента, типичная запись плетизмографии и ЭМГ длится 1 - 3 часа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Передатчик имеет собственную частоту дискретизации 240 Гц. Более высокая частота 500 Гц устанавливается в программном обеспечении для интерполяции между точками и обеспечения более плавной формы волны. Фильтр нижних частот (который служит фильтром сглаживания) и фильтр высоких частот в имплантате определяют полосу пропускания от 1 до 50 Гц для этого устройства телеметрии. Помехи переменного тока частотой 60 Гц не способствуют избыточному шуму в сигнале ЭМГ, поскольку имплантаты питаются от батареек, а животное защищает имплантат и провода от электрических полей. Плетизмография, ЭМГ и видео автоматически синхронизируются в режиме реального времени через программное обеспечение для сбора данных .
7. Когда поимка будет закончена, выключите передатчик с помощью магнита и извлеките животное из камеры.

Результаты

Рисунок 1. Имплантация телеметрического устройства для измерения ЭМГ дыхательных мышц. (А) Телеметрические передатчики с двумя парами биопотенциалов приводят к измерению ЭМГ. Провода могут быть об...

Материалы