Этот протокол описывает контролируемое вливание аутологичной крови в понтинную область мозга крысы для моделирования массивного понтинного кровоизлияния. Цель состоит в том, чтобы смоделировать локализованное кровоизлияние в мозг за счет увеличения локализованного давления.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Индуцирование массивного понтинного кровоизлияния у модели крысы путем введения аутологичной крови
1.1K просмотров
⸱
28 апреля 2025 г.
В этой статье
Аннотация
Протокол
Все процедуры, связанные с моделями животных, были рассмотрены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
- Животные и инструменты
- Используйте 8-недельных самцов крыс Sprague-Dawley весом 250 ± 10 г.
- Разместите крыс по крайней мере за 7 дней до операции в контролируемых условиях окружающей среды с температурой окружающей среды 25 °C, относительной влажностью 65% и 12/12-часовым циклом свет-темнота.
- Предоставьте еду и воду без ограничений.
- Подготовьте инструменты (Рисунок 1A-E).
2. Введите кровь в pons
- Снова взвесьте крыс за 3 дня до операции, чтобы выбрать крыс с подходящей массой тела для экспериментов.
- В течение 3 дней перед моделированием тренируйте крыс ходить по бревну 3 раза в день, чтобы убедиться, что нормальные крысы могут проходить по бревну без пауз.
- Разогрейте грелку до 37 °C перед анестезией.
- Прикрепите микродрель к держателю на стереотаксической раме.
- Введите крысам 50 мг/кг кетамина и 5 мг/кг ксилазина внутрибрюшинно. Подождите, пока не исчезнет реакция на щипот пальца ноги.
- Перенесите крысу в стереотаксический кадр в положении лежа. Поместите ушные планки над ушным каналом, чтобы зафиксировать голову. Зафиксируйте череп в горизонтальном положении, чтобы избежать перекоса инъекции (Рисунок 1F).
- Поддерживайте анестезию изофлураном (97,5% кислорода и 2,5% изофлурана) через стереотаксический носовой конус с входным и выходным портами.
- Используйте глазную мазь, чтобы сохранить роговицу влажной.
- Сбрейте волосы над черепом с помощью микробритвы.
- Нарисуйте маркером среднюю линию длиной 3 см в черепе от линии двустороннего бокового кантуса до 0,5 см позади заднего родничка, как показано на рисунке 1F.
- Нанесите хирургический скраб Entoiodine по кругу, начиная с середины отмеченной средней линии и вращаясь наружу.
- Разместите хирургическую простыню.
- Сделайте надрез скальпелем вдоль отмеченной средней линии.
- Используйте ватную палочку, чтобы удалить любую потенциальную кровь.
- Поместите кусочек щипцов с каждой стороны лоскута для кожи головы, чтобы обнажить череп (Рисунок 1G).
- Обмакните ватный тампон в 0,9% физиологический раствор и аккуратно удалите соединительные ткани из кости черепа, чтобы соединительные ткани не попали в микросверло.
- Отметьте центральную точку брегмы как исходную точку с помощью маркера.
- Выполните трепанацию черепа (1 мм в диаметре) с помощью микросверла на AP-9,0 мм, широте 0 мм (Рисунок 2B и Таблица 1). Действуйте осторожно, потому что эта точка находится очень близко к венозному синусу (рисунок 1G).
- Удалите микродрель из стереотаксической рамки.
- Вставьте шприц Hamilton объемом 100 мкл в стереотаксический держатель (рис. 1K). Включите переключатель инжекторного насоса, нажмите кнопку «Быстрая ингаляция», аспирируйте раствор гепарина (12500 ЕД разведенный в 100 мл физиологического раствора) до 100 μл, а затем полностью слейте его, чтобы предотвратить слишком быстрое свертывание крови.
- Нанесите хлоргексидин и 75% спиртовой хирургический скраб на весь хвост от корней до кончиков не менее 3 раз, чтобы продезинфицировать кожу, смягчить возбуждение и расширить хвостовую вену, чтобы увеличить вероятность успеха инъекции.
- Прикрепите акупунктуру для кожи головы к шприцу объемом 1 мл.
- Вставьте акупунктуру кожи головы в боковую вену хвоста на расстоянии 3 см от кончика хвоста и возьмите 150 μл крови (Рисунок 1H).
- Удалите акупунктуру кожи головы из шприца объемом 1 мл.
- Переведите кровь в пробирку (Рисунок 1I).
ПРИМЕЧАНИЕ: Быстро переносите, чтобы предотвратить свертывание крови. - Смените хирургические перчатки.
- Выберите режим вывода, установите объем на 100 μл, установите скорость на 200 μл/мин, нажмите кнопку RUN и всосывайте 100 μL крови в шприц Hamilton (Рисунок 1J).
- Выберите режим Infuse и установите скорость 1 μL/мин.
- Продвигайте шприц до тех пор, пока кончик не достигнет 9,2 мм ниже поверхности мозга (Рисунок 2C и Рисунок 1L).
- Нажмите кнопку «Выполнить», чтобы ввести первые 10 μL крови со скоростью 1 μL/мин (Таблица 1).
- Остановите инъекцию и оставьте шприц в нужном положении на 20 минут, чтобы предотвратить попадание крови в субарахноидальное пространство.
- Втяните шприц, пока кончик не окажется на 9,0 мм ниже поверхности мозга.
- Возобновите инъекцию с той же скоростью 1 μл/мин, пока остаточная кровь не будет введена полностью.
- Оставьте шприц в нужном положении на 10 минут, чтобы избежать обратного тока крови.
- Медленно извлекайте шприц из мозга.
- Используйте костный цемент, чтобы закрыть отверстие для краниотомии.
- Когда цемент высохнет, зашите рану полиамидной нитью 4-0. После пришивания 3 или 4 стежков завяжите 2-1-1 стандартные хирургические узлы.
- Чтобы предотвратить заражение, введите крысе пенициллин (0,25 мл, 80 МЕ, разведенный в 4 мл физиологического раствора) внутрибрюшинно.
- Введите крысам подкожно тартрат буторфанола (2,5 мг/кг) и повторяйте инъекцию каждые 2 часа, чтобы облегчить послеоперационную боль до 24 часов после операции.
- Наблюдайте за крысой каждые 15 минут, пока она полностью не оправится от анестезии. Верните его в исходную клетку, поместив под клетку грелку. Обеспечьте крысе свободный доступ к пище и воде до жертвоприношения.
Таблица 1: Инъекция аутологичной крови.
Mild
| < | Moderate | Massive | |
Total volume | 30 μL | 60 μL | 100 μL |
First injection | |||
Stereotactic coordinates | AP -9.0 мм; широта 0; Vert -9.2 mm | ||
Volume | 10 μL | 10 μL | 10 μL |
Speed | 1 μL/min | 1 μL/мин | 1 μL/min |
Interval time | 20 мин | 20 мин | 20 мин |
Second injection | |||
Stereotactic coordinates | AP -9.0 мм; широта 0; Vert -9.2 мм | AP -9.0 мм; широта 0; Vert -9.0 mm | |
Volume | 20 μL | 50 μL | 90 μL |
Speed | 1 μL/min | 1 μL/мин | 1 μL/min |
Перед извлечением иглы | 10 min | 10 min | 10 min |
AP: переднезаднее положение | |||
Lat: lateral | < | ||
Vert: vertical | < | ||
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Рисунок 1: Инструменты и процедура хирургического вмешательства. (А) Аппарат для анестезии. (B) Хирургические инструменты. (В) Микробур. (D) Микроинжекторный насос. (E) Стереотаксический аппарат. (F) В середине черепа отмечается линия. (G) Желтая стрелка указывает на место бурения. (H) Отток крови из хвостовой вены. (I) Перелейте к...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 100ml Солевой раствор< | 191222201 C1 | Подготовка разбавителя | |
| 100μl Microinjector | Шанхайский гаогэ | Инъекция автологичной крови | |
| 1ml Шприц< | 20191014 | Изъять аутологичную кровь из хвостовой вены | |
| 75% Alcohol | Shandong Lierkang | Дезинфекция крысиного хвоста | |
| Клейкая лента | Шанхай Цзиньчжун | Surgicl instruments | |
| Система анестезии животных | RWD | Индукция и поддержание анестезии | |
| Балансировочный луч< | Для оценки неврологического дефицита | ||
| Bone cement | Shanghai Xinshiji | 20180306 | Инструменты |
| Butorphanol tartrate< | For pain management | ||
| Электрическая дрель для черепа | Nanjing Darwin biotechnology | 20180090018 | Делаем отверстие для заусенцев на черепе |
| EP tube | Nantong Surui | < | |
| Erythromycin eye cream | Yunnan pharmacy | < | |
| Грелка | Опасные джунгли | JR01 | Сохраняя тепло< |
| Chengdu Haitong Pharmacal Company | 190701 | Приготовление разбавителя | |
| IndoPhors | Guoyao of China | < | |
| Isoflurane | RWD | 20080701 | Индуцирование и поддержание анестезии |
| Micro-injection pump | Baoding Leifu | TFD03-01-C | Инъекция аутологичной крови |
| Иглодержатель | Shanghai Jinzhong< | Surgicl instruments | |
| Penicilin | Гояо из Китая | < | |
| Q-tips | Jiangxi Songhe | < | |
| Scalp needle | 20200313 | Изъять аутологичную кровь из хвостовой вены | |
| Scalpel | Шанхай Kaiyuan | 170902< | |
| Ножницы для стрижки | Шанхай Цзиньчжун | Y00040 | Surgicl instruments |
| Stereotaxic apparatus | RWD | 900-00001-00 | Для хирургического позиционирования |
| Хирургическое полотенце< | 20070601 | Surgicl instruments | |
| Шовная игла | Шанхай Цзиньчжун | Surgicl instruments | |
| Нож<ницы для швов | J25041 | Surgicl instruments | |
| Tissue holding stickps | Шанхай Цзиньчжун | J31080 | Инструменты Surgicl |
