$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Сборка очков для мышей
- Подготовьте детали, необходимые для сборки очков (Рисунок 1a). Для каждой мыши подготовьте следующее: одну нейлоновую палочку, установленную на голове, одну верхнюю и одну нижнюю титановую раму, две линзы с соответствующей мощностью в соответствии с целью эксперимента, один винт размера M1.4 длиной 10 мм, одну гайку для винта размера M1.4, одну гладкую шайбу для винта размера M1.4 толщиной 0,3 мм, и два искусственных кончика ногтей. ПРИМЕЧАНИЕ: Существуют два вида рамок с разной высотой. Для одной мыши в комплекте используется одна верхняя рамка и одна нижняя рамка. Более высокие кадры следует ставить над нижними, чтобы сделать поля зрения симметричными. Оправы и линзы специально разработаны и изготовлены авторской исследовательской группой. С ними можно ознакомиться, связавшись с авторами этой статьи. Другие детали можно найти в розничных магазинах инструментов.
- Соберите оправу для правого и левого глаза отдельно.
- Расположите кончик ногтя лицом к внешней стороне, чтобы добиться наилучшего защитного эффекта. Отрегулируйте угол между кончиком ногтя и рамкой примерно на 130°, чтобы не маскировать поле зрения мыши (Рисунок 1b). Приклейте кончики искусственных ногтей к каркасу с помощью цианоакрилатного клея.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кончики ногтей могут помочь защитить линзу от царапин мышью. Направление кончиков ногтей должно быть противоположным, потому что верхняя рамка и нижняя рамка используются для правого глаза и левого глаза соответственно. - Подождите не менее 12 часов, чтобы клей полностью высох, затем с помощью кусачки для ногтей отрегулируйте форму кончиков ногтей примерно на 1 см × 1 см путем обрезки и обрезки.
- Приклейте линзу к оправе с помощью цианоакрилатного клея. Наденьте объектив на оправу рукой и держите оправу горизонтально. Введите цианоакрилатный клей с края линзы и дайте клею распространиться за счет поверхностного натяжения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клей разрушает линзу и влияет на ее прозрачность, поэтому убедитесь, что клей касается только периферийной части линзы. Используйте 0 диоптрий (D) Плоскую линзу в качестве контрольной и минусовую линзу для индуцирования близорукости. Эффект разной мощности минусовых линз (от –10 D до –50 D) был описан в другом месте4. Чтобы максимизировать стимуляцию близорукости, рекомендуется использовать линзу –30 D для индуцирования близорукости. FDM также можно вызвать с помощью того же устройства, просто заменив линзу на колпачок микротрубки объемом 1,5 мл в качестве диффузора.
- Затяните винт в капроновую палочку вместе с шайбой с плоской стороны палочки. Подготовьте очки и палочки перед экспериментом и запаситесь ими для дальнейшего использования (Рисунок 1c).
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь.
2. Фиксация рамы на черепной коробке мыши.
- Нанесите одну каплю 0,1% очищенной глазной капли гиалуроната натрия, чтобы предотвратить сухость на каждом глазу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Глазные капли на поверхности глаза влияют на значения рефракции и измерения осевой длины. Не используйте глазные капли после анестезии, пока не будут проведены все измерения. - Положите подбородок мыши, находящейся под наркозом, на склон из глины или чего-нибудь еще, что можно использовать в качестве подушки, чтобы передняя плоскость черепа была горизонтальной.
- Простерилизуйте волосы и кожу головы между ушами и глазами с помощью ватного тампона с 70% этанолом.
- Разрежьте кожу между ушами и глазами, чтобы обнажить череп примерно на 0,8 sq.cm с помощью хирургических ножниц и пинцета. Используйте стоматологическую жидкость для травления и ватный тампон для удаления надкостницы. Стерилизуйте хирургические ножницы и пинцет с 70% этанолом перед операцией каждой мыши.
ПРИМЕЧАНИЕ: Может потребоваться стрижка волос и ношение стерильных перчаток. Перед этой процедурой ознакомьтесь с положениями соответствующего комитета по уходу за животными. В большинстве случаев жидкость для травления зубов является одной из насадок в самоотверждающейся стоматологической адгезивной системе. Если жидкость для травления зубов недоступна, используйте вместо нее 70% этанол. - Соберите набор оправ без объектива, чтобы зафиксировать палку в правильном положении. Поместите рамки на голову мыши. Тщательно отрегулируйте положение оправы, чтобы убедиться, что оба глаза находятся в середине пустой оправы.
- Используйте самоотверждающуюся стоматологическую адгезивную систему, чтобы прикрепить палочку к голове мыши. Будьте осторожны, чтобы жидкость из адгезионной системы не попала в глаз мыши.
ПРИМЕЧАНИЕ: Метод использования самоотверждающейся стоматологической адгезивной системы отличается в зависимости от продукта. Внимательно обратитесь к инструкции.
ВНИМАНИЕ: Некоторые реагенты в стоматологической адгезивной системе могут быть токсичными. - Подождите около 5 минут и осторожно снимите раму и гайку, не меняя положения палочки (Рисунок 2a).
- Введите 0,75 мг/кг атипамезола гидрохлорида внутрибрюшинно, чтобы помочь мыши быстрее восстановиться после анестезии. Поместите мышь в индивидуальную клетку до полного восстановления. Не оставляйте мышь без присмотра до тех пор, пока она не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине. Протокол можно поставить на паузу здесь.
3. Начало индукции миопии и последующее поддержание
- Подождите не менее 24 часов после операции, чтобы мышь полностью восстановилась после анестезии. Возьмитесь за палочку и наденьте оправы с линзами. Побуждение начинается в этот момент времени (Рисунок 2b).
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму дискомфорт во время восстановления после анестезии и дать достаточно времени для коагуляции стоматологической адгезивной системы, настоятельно рекомендуется надевать каркас после того, как мыши полностью оправятся от анестезии. Смоляной цемент адгезивной системы полностью покроет порез кожи головы. Таким образом, не требуется специфического послеоперационного лечения для предотвращения инфекции и облегчения послеоперационной боли. Сразу после первого надевания оправы мыши будут слишком сильно осознавать существование объектива и будут много его царапать. Грубое поведение вернется в норму через несколько часов. Мышей с линзами можно содержать с той же плотностью, что и обычных мышей. - Снимайте оправу и очищайте линзы и кончики ногтей ватными тампонами не реже двух раз в неделю, чтобы сохранить прозрачность линзы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости подвергать мышь анестезии для снятия и надевания рамы. Предоставление поддержки мышам, на которых они могут сидеть, вместо того, чтобы они висели во время работы с ними, может уменьшить дистресс. - Если необходимо провести промежуточное измерение, поместите мышь под наркоз и измерьте мышь, как описано выше. Стимуляцию можно продолжить после того, как мышь оправится от анестезии.
- Чистите клетку не реже двух раз в неделю.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это помогает сохранить четкость объектива. Также может быть полезно проложить сетку между мышью и дном клетки для фильтрации остатков пищи. - Следите за массой тела и грубым поведением. Сравните их с ровесниками нетронутыми мышами в течение всего экспериментального процесса.
ПРИМЕЧАНИЕ: За исключением некоторых почесываний, никаких существенных изменений, включая массу тела, не обнаружено между экспериментальными мышами и мышами, не прошедшими лечения.
