Влияние кислородно-глюкозного голодания и реоксигенации на межклеточные взаимодействия

Аннотация

Источник: Alluri, H., et.al. Кислородно-глюкозное голодание и реоксигенация как модель ишемии-реперфузионного повреждения in vitro для изучения дисфункции гематоэнцефалического барьера. J. Vis. Exp. (2015).

В видеоролике показано влияние кислородно-глюкозного голодания и последующей реоксигенации на микрососудистые эндотелиальные клетки (RBMECs) головного мозга крыс путем моделирования гипоксических и лишенных питательных веществ условий. Эти условия приводят к истощению АТФ, увеличению внутриклеточного кальция и образованию активных форм кислорода (АФК), которые разрушают белки клеточного соединения и вызывают образование стрессовых волокон, тем самым ослабляя межклеточные взаимодействия.

Протокол

1. Посев эндотелиальных клеток

1. Получите первичные культуры RBMEC от взрослых крыс Sprague Dawley (или получите их в коммерческих целях).

2. Культивируйте RBMECs в чашках Петри, покрытых 100 см фибронектином (50 мкг/мл), используя среду для роста эндотелиальных клеток мозга крысы. Меняйте среду каждые два дня до тех пор, пока не будет достигнуто слияние.

3. По достижении 80-90% конфлюенции аккуратно промойте клетки в 5 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) путем перемешивания. Затем клетки отделяют путем воздействия на них 1 мл теплого 0,25% раствора трипсин-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), уравновешенного до 37 °C.

4. Инкубируйте клетки при температуре 37 °C в течение 2-5 минут, пока клетки не отделятся и не рассеются. ПРИМЕЧАНИЕ: Постучите по чашке для культивирования, чтобы отделить клетки. Рассмотрите клетки под микроскопом, чтобы убедиться в полном отрыве клеток от поверхности чашки.

5. Добавьте 5 мл готового средства в чашку Петри для того, чтобы нейтрализовать трипсин. Выведите пипетку из среды, содержащей отделенные клетки, и соберите ее в центрифужную пробирку объемом 15 мл.

6. Центрифугируйте среду, содержащую эндотелиальные клетки, при 220 x g в течение 5 мин.

7. Аспирируйте надосадочную жидкость и сохраняйте гранулы, содержащие клетки. Суспензируйте гранулу в 3-5 мл свежей среды для роста эндотелиальных клеток мозга крысы, осторожно перемешивая ее вверх и вниз пипеткой. Затем клетки будут подсчитаны с помощью автоматического счетчика клеток или гемоцитометра.

8. Перенесите клеточную суспензию в предварительно покрытую фибронектином (50 мкг/мл) 8-луночную стерильную камерную систему предметного стекла, 0,7 кв. см/лунку с плотностью затравки в пределах 10 000-15 000 клеток на лунку. Выращивайте клетки при температуре 37 °C до тех пор, пока не будет достигнуто слияние ПРИМЕЧАНИЕ: Для проведения вестерн-блоттинга или других экспериментов клетки могут быть выращены в 10-сантиметровых чашках для клеточных культур или специальных чашках в соответствии с требованиями эксперимента.

2. Кислородная и глюкозная депривация-реоксигенация в модели in vitro

1. Используйте систему культивирования клеток гипоксии для изучения влияния OGD-R на RBMEC (см. Рисунок 1). Настройте и откалибруйте систему культивирования клеток гипоксии перед началом эксперимента в соответствии с инструкциями производителя.

2. Снимите предметные стекла сливающейся камеры (шаг 1.8) с инкубатора при температуре 37 °C. Замените всю среду в предметном стекле камеры на дезоксигенированную, не содержащую глюкозы, модифицированную среду Дульбекко (DMEM) и поместите ее в камеру гипоксии с 95% азотом и 5% углекислым газом на 2 часа при 37 °C, чтобы представить состояние OGD.

3. Переместите клетки обратно в инкубатор с 95% кислорода, 5% углекислого газа при температуре 37 °C и со свежей средой для эндотелиальных клеток мозга крысы и инкубируйте еще 1 час при температуре 37 °C.

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг представляет собой ситуацию реоксигенации.

Результаты

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Proox model 110	Biospherix	Model 110
DMEM, no glucose	Gibco, Life technologies	11966-025
Rhodamine Phalloidin	Life technologies	R415
ZO-1 Rabbit Polyclonal Antibody	Life technologies	617300
Nunc Lab Tek II-CC 8 хорошо стерильный, стеклянные стекла	Thermo scientific	177402
с тегом FITC-помеченный anti-rabbit secondary антитело	Santa cruz	sc-2090
DPBS 1X	Thermo scientific	SH 30028.03	Любой другой доступный PBS может быть использован