Нативная хроматиновая иммунопреципитация клеток нейросферы

Аннотация

Источник: Мендес, Ф. М. et al., Нативная иммунопреципитация хроматина с использованием нейросфер опухолей головного мозга мышей. J. Vis. Exp. (2018).

В этом видео демонстрируется выделение комплексов белок-ДНК из клеток нейросферы, полученных из опухоли мозга мыши, с использованием нативной иммунопреципитации хроматина. В нем подробно описаны этапы подготовки хроматина, иммунопреципитации, промывки и переваривания белка для высвобождения ДНК для последующего анализа.

Протокол

1. Нативная иммунопреципитация хроматина (ChIP)

1. Препарат хроматина
   1. После создания запаса производных клеток нейросферы (НС) культивируют НС в колбе Т-75 в 15 мл среды НСК при 37 °С в инкубаторе для тканевых культур с атмосферой 95% воздуха и 5% СО₂ до тех пор, пока НС не слится. Одна сливающаяся пластина Т-75 даст 3-5 X 10⁶ клеток.
   2. Когда клетки сливаются, центрифугируйте NS при 300 x g в течение 5 минут, сцеживайте надосадочную жидкость и добавляйте 1 мл среды для диссоциации клеток. Инкубируйте клетки при температуре 37 °C в течение 5 минут. Добавьте 5 мл среды и посчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 1 x 10⁶ клеток необходимы для реакции иммунопреципитации (IP). Обратите внимание, что также должна быть включена предиммунная сыворотка или контроль IgG.
   3. Центрифугируйте NS в одной микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл при 300 x g в течение 5 мин, сцеживайте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу NS с 1 мл сбалансированного раствора соли и переведите суспензию в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл с низким связыванием белков.
   4. Центрифугируйте NS при 300 x g в течение 5 мин, сцеживайте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 95 μL буфера для сбраживания (50 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM CaCl₂, 0,2% октилфениловый эфир полиэтиленгликоля) на 1 x 10⁶ клеток с добавлением коктейля ингибиторов протеазы в высокой концентрации (1:100). Немедленно проведите пипеткой клетки вверх и вниз, чтобы предотвратить образование комков и образования пузырьков.
   5. Ресуспендируйте микрококковую нуклеазу (MNase) в 50% глицерине с получением раствора 1 мг/мл (1,15 ед./мкл, хранящегося при -20 °C), который будет называться «1x» бульоном. Сделайте бульон "0,1x", сделав второе разведение 1:9 с 50% глицерина (e.g., 900 μл "1x" MNазы и 100 μл 50% глицерина) и храните его при -20 °C.
   6. Смешайте 5 μл "0,1x" MNазы и 145 μл буфера для разложения. Держите фермент на льду все время. Добавьте 5 мкл разведенной МНазы в буфер для разложения на 1 x 10⁶ клеток. Перемешайте тюбик и поместите пробирку в блок с температурой 37 °C ровно на 12 минут. Обрабатывайте образцы по одному, чтобы обеспечить точное время инкубации 12 минут.
   7. Добавьте 10 μL 10x MNase Stop Buffer (110 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 55 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА)) на 1 x 10⁶} клеток. С этого момента образцы должны храниться на льду.
   8. Добавьте 110 мкл "2x буфера для радиоиммунопреципитационного анализа (RIPA)" (280 мМ NaCl, 1,8% октилфенилового эфира полиэтиленгликоля, 0,2% додецилсульфата натрия (SDS), 0,2% Na-дезоксихолата, 5 мМ этиленгликол-биса (β-аминоэтиловый эфир)-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты (EGTA); хранящейся при 4 °C) с добавлением коктейля ингибиторов протеазы в высокой концентрации (1:100) на 1 x 10⁶} клеток. Переведите тюбик для смешивания.
   9. Центрифугируйте пробирки в течение 15 минут в микрофуге при температуре 4 °C и 1700 x g. Перенесите надосадочную жидкость в новую обычную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл (микроцентрифужные пробирки с низким связыванием белка больше не нужны) и храните их на льду. Выбросьте гранулы.
      
2. Иммунопреципитация (IP)
   1. Смешивайте магнитные шарики протеина А и протеина G в соотношении 1:1. На каждый ИП подготовьте 25 μл бусин.
   2. Промойте шарики, добавив 1 мл буфера RIPA (10 мМ Tris pH 8,0, 1 мМ ЭДТА, 140 мМ NaCl, 1% октилфенилового эфира полиэтиленгликоля, 0,1% SDS, 0,1% Na-дезоксихолата; хранят при 4 °C) с добавлением ингибиторов протеазы в низкой концентрации (1:1000).
   3. С помощью магнита отсоедините шарики от моющего раствора и сцедите раствор для стирки (примерно 1 минута). Выполните этап стирки дважды.
   4. Суспендируйте шарики до исходного объема с помощью буфера RIPA с добавлением ингибиторов протеазы (1:1000).
   5. При необходимости разбавляют хроматин с помощью буфера RIPA с добавлением ингибиторов протеазы (1:1000) так, чтобы каждый IP имел объем 100-200 μL. Резервируйте для ввода 10% объема, используемого на IP хроматина.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Например, если используется 200 μL на IP, 20 μL разбавленного хроматина должны быть зарезервированы для входа. Для четырех IP общий объем хроматина должен быть разбавлен до 820 μL.
   6. Подготовьте вход. Добавьте 100 мкл TE буфера (10 мМ Tris-HCl pH 8,0, 1 мМ ЭДТА) с добавлением протеиназы К (0,5 мг/мл) во вход и инкубируйте вход при 55 °C в течение 1 ч.
   7. Очистите вход с помощью набора для очистки полимеразной цепной реакции (ПЦР) в соответствии с инструкциями производителя и разбавьте 50 мкл элюирующего буфера, входящего в комплект.
   8. Измерьте концентрацию входного сигнала с помощью микрообъемного спектрофотометра и запишите результаты в блокнот. Заготовка с элюирующим буфером из комплекта.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В нейросферах мышей мы использовали примерно 6 μг ДНК для каждого IP.
   9. Запустите ввод на 1% геле или загрузите 1 мкл в биоанализатор ДНК с использованием стандартных настроек. Сохраните оставшуюся часть для использования в качестве входных данных в последующих приложениях.
   10. Добавьте 10 μL промытых магнитных шариков белка A & G для каждой IP и инкубируйте IP в течение 1 часа при 4 °C.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Например, добавьте 30 μL магнитных шариков белка A & G для трех IP.
   11. Поместите образцы на магнит и дайте бусинам разойтись. Разделите хроматин, перенеся ранее определенное количество в новую пробирку объемом 1,5 мл.
   12. Добавьте антитело и оберните крышки пластиковой парафиновой пленкой, чтобы избежать испарения. Инкубируйте образцы в течение ночи при температуре 4 °C с вращением со скоростью 20 об/мин.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрацию следует определять опытным путем, следуя рекомендациям производителя.
   13. На следующий день вращайте пробирки с помощью миницентрифуги при комнатной температуре, 2000 x g, в течение 10 секунд. Затем добавьте 10 мкл гранул в каждый IP и инкубируйте IP в течение 3 ч при 4 °C с вращением со скоростью 20 об/мин.
       
3. Промывка и переваривание белка
   1. }{{}}}{{}}Добавьте 150 μЛ буфера RIPA с добавлением ингибиторов протеазы в низкой концентрации (1:1000) в каждый IP и инкубируйте IP при 4 °C с вращением при 20 об/мин в течение 5 минут. Поместите образец на магнитную подставку и дайте магнитным шарикам разойтись. С помощью пипетки удалите надосадочную жидкость. Повторите этот шаг пять раз.
   2. Добавьте 150 мкл буфера на основе хлорида лития (LiCl) (250 мМ LiCl, 10 мМ Tris pH 8,0, 1 мМ ЭДТА, 0,5% NP-40, 0,5 % Na-дезоксихолата; хранить при 4 °C) с добавлением ингибиторов протеазы в низкой концентрации (1:1000) к каждому IP и инкубируйте IP при 4 °C с вращением при 20 об/мин в течение 5 мин. Поместите образец на магнитную подставку и дайте магнитным шарикам отделиться. С помощью пипетки удалите надосадочную жидкость.
   3. Добавьте 150 мкл холодного Tris-EDTA (TE) (без ингибиторов протеазы) и инкубируйте образец при 4 °C с вращением при 20 об/мин в течение 5 минут. Поместите образец на магнитную подставку и дайте магнитным шарикам отделиться. С помощью пипетки удалите надосадочную жидкость.
   4. После заключительной стадии промывки повторно суспендируйте образец в 100 мкл TE-буфера с добавлением протеиназы К (0,5 мг/мл) и инкубируйте образец при 55 °C в течение 1 ч.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent	G2946-90004	bioanalyzer
AccuSpin Micro 17R, рефрижераторный	Fisher Scientific	13-100-676
C57BL/6	Taconic	B6-f	C57BL/6 mouse
Calcium Chloride	Aldrich	22350-6	buffer reagent
D-люциферин, калийная соль<	LuckK-1g
DiaMag1.5 magnetic rack	Diagenode	B04000003	for magnetic bead washes
DiaMag Rotator EU	Diagenode	B05000001	rotator
DMEM/F-12	Gibco	11330-057	NSC component
Dynabeads Protein A	Thermo Fisher Scientific	10001D	protein A magnetic beads
Dynabeads Protein G	Thermo Fisher Scientific	protein G magnetic beads
EGF	AF-100-15	prepare 20 μg/mL stock в 0.1% BSA и аликвоте.
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)	Sigma	buffer reagent
Этиленгликоль-бис(β-аминоэтиловый эфир)-N,N,N',N'-тетрауксусная кислота) (EGTA)	Sigma	E-4378	буферный реагент
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота	Gibco	10437028	for freezing cells
FGF	PeproTech	100-18b	Подготовьте 20 μг/мл запаса в 0.1% BSA и аликвоте.
Щипцы	Инструменты для изучения науки	11008-13	для вскрытия опухоли<
EMD- Millipore	356352
HBSS	Gibco	14175-103	balanced salt solution
Fluriso	VETone	501017	ингаляционный анестетик
Ivis Spectrum	Perkin-Elmer	124262	in vivo optical imaging system
Hyqtase	HyClon	SV3003001	cell unit unit media
Lithium Chloride	Sigma	L8895	buffer reagent
Микротрубки с низким связыванием	Corning Costar	CLS3207	low пробирка микроцентрифуги для связывания белка
Microcentrifuge tube	Fisher	21-402-903	обычная микроцентрифужная трубка
Micrococcal Nuclease	Thermo Fisher Scientific, Affymetrix<		N2	Gibco	17502-048	NSC component
Normocin	Invivogen	NOL-36-063	антимикробное средство, использование при 0,1 мг/мл.
NP-40 (Igepal CA-630)	Sigma	18896-50ML	buffer reagent
Kimble Kontes Pellet Pestle	Fisher Scientific	K749515-0000
Коктейль ингибитора протеазы	Sigma-Aldrich	P8340	aliquot и хранить при -20 °C.
Protinase K	Sigma-Aldrich	P2308	сделать запас 10 мг/мл в воде; aliquot и хранить при -20 °C.
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	набор для очистки ДНК
Scalpel	Инструменты для изобразительной науки	10007-16	для вскрытия опухоли
Sodium Chloride	VWR	0241-5KG	буферный реагент
Sodium Deoxycholate	Sigma-Aldrich	D670-25G	buffer reagent
Додецилсульфат натрия (SDS)	Sigma	L-4390	buffer reagent
Tris Base	Thermo Fisher Scientific	Bp152-1	buffer reagent
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	BP 151-500	полиэтиленгликоль октилфениловый эфир
Стандартная мини-центрифуга<	12-006-901	стандартная мини-центрифуга
SZX16 microscope	Olympus	SZX16	флуоресцентный препарирующий микроскоп
Nanodrop One	Thermo-Fisher Scientific	ND-ONEC-W

td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Goldbiotr style='height:19px;'>td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>70196Ytd style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Fisherbrand