Проведение двойной флуоресцентной гибридизации in situ для выявления экспрессии генов в срезах мозга мыши

Аннотация

Источник: Джолли, С., et.al. Сочетание двойной флуоресценции in situ гибридизации с иммуномечением для обнаружения экспрессии трех генов в срезах мозга мыши. J. Vis. Exp. (2016).

В этом видео демонстрируется использование двойной флуоресцентной гибридизации in situ для визуализации экспрессии двух РНК-мишеней в срезах мозга мыши. Протокол включает последовательное обнаружение РНК с помощью зондов, меченных флуоресцеином изотиоцианатом и дигоксигенином, с последующей усилением ферментативного сигнала для повышения чувствительности. Полученная флуоресценция позволяет проводить анализ локализации целевых РНК в ткани.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.

1. Гибридизация

1. Приготовьте промывочный буфер при 65 °C: 150 мМ NaCl, 15 мМ Na₃C₃H₅O(COO)₃ (= 1x цитрат натрия с солевым раствором), 50% (v/v) формамид и 0,1% (v/v) Tween-20.
2. Приготовьте буфер MABT: 100 мМ малеиновой кислоты, 150 мМ NaCl, 0,1% (v/v) Tween-20, pH 7,5.
3. Разбавьте два зонда (меченый DIG и меченый FITC) на 1/1 000 в буфере для гибридизации (обработанная DEPC деионизированная вода с 50% (v/v) деионизированного формамида, 200 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА, 10 мМ Tris-HCl pH 7,5, 5 мМ NaH₂PO₄, 5 мМ Na₂HPO₄, 0,01 мг/мл тРНК дрожжей, 1× раствор Денхардта и 10% w/v сульфат декстрана) предварительно подогревают до 65 °C и хорошо перемешивают.
4. Нанесите около 300 μл гибридизационной смеси на каждое предметное стекло, обожгите в духовке (200 °C) и инкубируйте O/N при 65 °C в увлажненной камере.
5. Переложите предметные стекла в банку Coplin, содержащую предварительно подогретый буфер для стирки. Вымойте предметные стекла в течение 30 минут дважды при температуре 65 °C с буфером для стирки.
6. Промойте предметные стекла в течение 10 минут три раза с MABT на RT.

2. Визуализация зонда FITC

1. Приготовьте блокирующий буфер ISH: MABT с 2% блокирующим реагентом и 10% термоинактивированной сывороткой овец.
2. Дополнительно: с помощью гидрофобной ручки нарисуйте круги вокруг участков ткани на предметном стекле, чтобы уменьшить объем необходимых растворов антител.
3. Инкубировать предметные стекла в течение 1 часа при РТ с блокирующим буфером ISH в увлажненной камере.
4. Инкубируйте слайды O/N при 4 °C с пероксидазой хрена (POD)-конъюгированным антителом против FITC, разведенным в 1/500 (v/v) в блокирующем буфере ISH.
5. Поместите предметные стекла в банку Coplin, содержащую PBS с 0,1% (v/v) Tween-20 (PBST). Постирайте 3 раза по 10 минут в PBST и каждый раз заменяйте на свежий PBST.
6. Непосредственно перед применением приготовьте флуоресцентный тирамид, разбавив в 100 раз разбавитель Amplification. Для этого примера используйте ФИТК-тирамид.
7. Добавьте это на предметные стекла и оставьте на 10 минут в RT.
8. Поместите предметные стекла в банку Coplin и промойте 3 раза в PBST в течение 10 минут.

3. Визуализация зонда DIG

1. Приготовьте 0,1 м трис- HCl pH 8,2.
2. Инкубируйте предметные стекла с блокирующим буфером ISH в течение 1 часа при RT.
3. Инкубируйте предметные стекла при 4 °C с помощью щелочного антитела к фосфатазе (AP), разведенного на 1/1500 (v/v) в блокирующем буфере ISH.
4. Умыться с MABT в течение 10 мин три раза.
5. Дважды умыться 0,1 М Tris-HCl pH 8,2 в течение 5 минут при RT.
6. Непосредственно перед использованием приготовьте раствор Fast Red, растворив таблетки в 0,1 M Tris pH 8,2. Отфильтруйте раствор через фильтр 0,22 мкМ.
7. Инкубируйте предметные стекла при температуре 37 °C с раствором Fast Red в увлажненной камере. Поскольку время для оптимального развития варьируется, регулярно проверяйте предметные стекла с помощью флуоресцентного микроскопа, чтобы контролировать образование осадка. В этом примере остановите реакцию через 2 - 3 часа.
8. Промойте PBST в течение 10 минут три раза.

Материалы

style='border-left-style:none;border-top-style:none; '>Sigma

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Superfrost plus slides	Thermo Scientific	J1800AMNZ<
Sigma	S4641	Formamide	Sigma-Aldrich	F7503		Tween-20
Sigma-Aldrich	P1379
Coverslips	VWR International
Coplin Jar	Smith Scientific Ltd<
Blocking reagent	Roche	11096176001
Термоинактивированная сыворотка овец	Sigma	S2263	<
Cosmo Bio	DAI-PAP-S	09:20
α-FITC POD-conjugated antibody	11426346910
TSA™ Plus Fluorescein System	Perkin Elmer	NEL741001KT	26:00:00
α-DIG AP-conjugated	Roche	11093274910	<
Roche	11496549001
Mounting medium	Dako	S3023
Конфокальный микроскоп Leica SP2	Leica	<
.22 μM filter	Millex style='border-left-style:none;border-top-style:none;'>SLGP033RS<
Deionized formamide	Sigma	F9037	для блокировки буфера ISH
Sodium chloride	Sigma	S3014	<
VWR International	20252.29	<
S8282
Дигидрат диосновного фосфата натрия	Sigma	30435	<
Roche	10109495001
50x Решение Денхардта	Life Technologies	750018
Dextran sulfate	Sigma	D8906	<
Sigma	S2889	<
Sigma	T1503

td style='border-left-style:none;border-top-style:none;width:122pt;'> <td style='border-top-style:none; height:15.75pt;width:221pt;'>Sodium citratetd style='border-left-style:none;border-top-style:none;width:109pt;><>border-top-style:none;td style='border-top-style:none; height:15.75pt;width:221pt;'>Hydrophobic pentd style='border-top-style:none; height:15.75pt;width:221pt;'>Fast red tabletstd style='border-left-style:none;'> td style='border-left-style:none;'> td style='border-top-style:none;height:15.75pt;'>Соляная кислота td style='border-top-style:none;height:32.5pt;width:221pt;'>Sodium phosphate monobasicanhydroustd style='border-top-style:none;height:15.75pt;'>Дрожжевая тРНК td style='border-top-style:none;height:15.75pt;'>Ацетат натрия td style='border-top-style:none;height:15.75pt;'>Trizma Base