Проведение двойной флуоресцентной гибридизации in situ для выявления экспрессии генов в срезах мозга мыши

Аннотация

Источник: Джолли, С., et.al. Сочетание двойной флуоресценции in situ гибридизации с иммуномечением для обнаружения экспрессии трех генов в срезах мозга мыши. J. Vis. Exp. (2016).

В этом видео демонстрируется использование двойной флуоресцентной гибридизации in situ для визуализации экспрессии двух РНК-мишеней в срезах мозга мыши. Протокол включает последовательное обнаружение РНК с помощью зондов, меченных флуоресцеином изотиоцианатом и дигоксигенином, с последующей усилением ферментативного сигнала для повышения чувствительности. Полученная флуоресценция позволяет проводить анализ локализации целевых РНК в ткани.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.

1. Гибридизация

1. Приготовьте промывочный буфер при 65 °C: 150 мМ NaCl, 15 мМ Na₃C₃H₅O(COO)₃ (= 1x цитрат натрия с солевым раствором), 50% (v/v) формамид и 0,1% (v/v) Tween-20.
2. Приготовьте буфер ....

Материалы

style='border-left-style:none;border-top-style:none; '>Sigma

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Superfrost plus slides	Thermo Scientific	J1800AMNZ<
Sigma	S4641	Formamide	Sigma-Aldrich	F7503		Tween-20
Sigma-Aldrich	P1379
Coverslips	VWR International
Coplin Jar	Smith Scientific Ltd<
Blocking reagent	Roche	11096176001
Термоинактивированная сыворотка овец	Sigma	S2263	<
Cosmo Bio	DAI-PAP-S	09:20
α-FITC POD-conjugated antibody	11426346910
TSA™ Plus Fluorescein System	Perkin Elmer	NEL741001KT	26:00:00
α-DIG AP-conjugated	Roche	11093274910	<
Roche	11496549001
Mounting medium	Dako	S3023
Конфокальный микроскоп Leica SP2	Leica	<
.22 μM filter	Millex style='border-left-style:none;border-top-style:none;'>SLGP033RS<
Deionized formamide	Sigma	F9037	для блокировки буфера ISH
Sodium chloride	Sigma	S3014	<
VWR International	20252.29	<
S8282
Дигидрат диосновного фосфата натрия	Sigma	30435	<
Roche	10109495001
50x Решение Денхардта	Life Technologies	750018
Dextran sulfate	Sigma	D8906	<
Sigma	S2889	<
Sigma	T1503

td style='border-left-style:none;border-top-style:none;width:122pt;'> <td style='border-top-style:none; height:15.75pt;width:221pt;'>Sodium citratetd style='border-left-style:none;border-top-style:none;width:109pt;><>border-top-style:none;td style='border-top-style:none; height:15.75pt;width:221pt;'>Hydrophobic pentd style='border-top-style:none; height:15.75pt;width:221pt;'>Fast red tabletstd style='border-left-style:none;'> td style='border-left-style:none;'> td style='border-top-style:none;height:15.75pt;'>Соляная кислота td style='border-top-style:none;height:32.5pt;width:221pt;'>Sodium phosphate monobasicanhydroustd style='border-top-style:none;height:15.75pt;'>Дрожжевая тРНК td style='border-top-style:none;height:15.75pt;'>Ацетат натрия td style='border-top-style:none;height:15.75pt;'>Trizma Base