Иммунофлуоресцентное окрашивание инфицированной фиброваскулярной ткани пациента, полученной от геля

Аннотация

Источник: Gucciardo, E., et. al., Модель культуры тканей ex vivo для фиброваскулярных осложнений при пролиферативной диабетической ретинопатии. J. Vis. Exp. (2019)

В этом видео подробно описан протокол иммуноокрашивания для культур фиброваскулярной ткани ex vivo, встроенных в фибриновый гель. Это позволяет детально визуализировать сосудистые изменения, связанные с пролиферативной диабетической ретинопатией

Протокол

Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.

1. Иммунофлуоресцентное окрашивание по всему монтированию

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол длится 5 дней и может быть прерван при ночной инкубации, если это показано. Ни в коем случае не допускайте высыхания фибриновых гелей. Все действия выполняются в RT, если не указано иное.

1. Приготовьте следующие растворы перед началом протокола окрашивания.
   1. Раствор после фиксации: приготовьте раствор ацетона:метанола в соотношении 50:50, смешав равные количества ацетона и метанола (, например, 50 мл). Хранить при температуре -20 °C. Готовьте этот раствор не позднее чем за день до окрашивания. Этот раствор можно хранить при температуре -20 °C и использовать для последующих окрашиваний.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте этот раствор в вытяжном шкафу, так как ацетон и метанол легко воспламеняются и опасны для здоровья.
   2. Блокирующий раствор: приготовить 15% фетальную бычью сыворотку (FBS), 0,3% раствор этоксилата октилфенолфета в PBS путем предварительного добавления 15% FBS в PBS. Добавьте октилфенолэтоксилат и перемешайте до растворения. Хранить при температуре 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раствор можно заранее приготовить в больших количествах, хранить в 15 мл аликвот при -20 °C и размораживать перед использованием в день начала окрашивания. Используйте свежеприготовленные или только что размороженные аликвоты для каждого протокола окрашивания.
   3. Моющий раствор: Приготовьте 1 л PBS с добавлением 0,45% октилфенолэтоксилата, добавив 4,5 мл октилфенолэтоксилата к 995,5 мл PBS. Перемешайте до полного растворения. Храните в RT.
2. Осторожно снимите капли с пластины с помощью шпателя из нержавеющей стали с квадратными краями. Сначала отделите каплю от краев, прежде чем поднимать центр, и переложите в лунку из 12-луночного планшета, содержащую 1 мл PBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте шаги после фиксации, промывки и блокировки в этом формате пластины.
3. После этого зафиксируйте капли 1 мл ледяного раствора ацетона:метанола 50:50 на ~1 минуту (граница капель станет белой).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте этот этап в вытяжном шкафу, так как ацетон и метанол опасны для здоровья.
4. Ополосните 3–5 раз в 2 мл PBS (капли утонут в растворе PBS после завершения регидратации).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте прикосновения к каплям наконечником пипетки, так как после фиксации они прилипают к пластику. На протяжении всего протокола избегайте аспирации постфикса, антител, блокирующих и моющих растворов путем отсасывания, так как это может повредить или полностью уничтожить капли. Вместо этого наклоните планшет и осторожно удалите растворы с помощью пипетки объемом 500-5 000 мкл.
5. Центрифугируйте блокирующий раствор в течение 15 минут при 21 000 x g и 4 °C для удаления мусора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор может быть аликвотирован в пробирках объемом 1,5 мл для центрифугирования. Неиспользованный раствор можно хранить при температуре 4 °C и использовать для всех последующих этапов.
6. Инкубируйте капли в блокирующем растворе объемом 500 мкл в течение 2 ч при RT.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы уменьшить объем используемого блокирующего раствора, планшет можно наклонить на подставку и использовать всего 300 мкл раствора/капли.
7. Приготовьте первичную смесь антител (не менее 30 мкл/капля) при соответствующем разведении в блокирующем растворе и центрифугируйте в течение 15 мин при 21 000 x g и 4 °C.
8. Перенесите капли в 96-луночный планшет с круглым (U)-дном с помощью шпателя с закругленными краями и инкубируйте с не менее чем 30 мкл/каплей первичной смеси антител в течение ночи при 4 °C. {{TAG_ 99}}
9. На следующий день переложите капли в 12-луночный планшет, содержащий 2 мл моющего раствора/лунку, промойте сначала тремя 5-минутными промывками, а затем девятью 30-минутными промывками. Оставьте последнюю стирку (2 мл) на ночь при температуре 4 °C.
10. На следующий день трижды промойте PBS и переложите капли в круглую (U)-дно-96-луночную пластину.
11. Во время промывки приготовьте соответствующую смесь вторичных антител, конъюгированную с фторофором (разбавленную 1:500, не менее 30 мкл/капля) в блокирующем растворе и центрифугируйте в течение 15 мин при 21 000 x g и 4 °C.
12. } Перенесите капли в 96-луночный планшет с круглым (U)-дном с помощью шпателя с закругленными краями и инкубируйте с не менее чем 30 мкл смеси вторичных антител, в течение 4 ч по RT, защищен от света.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все последующие этапы инкубации и промывки в защищенном от света месте.
13. Переложите капли в 12-луночную пластину, содержащую 2 мл моющего раствора/лунку, с помощью шпателя с закругленными краями, промойте сначала тремя 5-минутными промывками, а затем четырьмя 30-минутными промывками. Оставьте последнюю стирку (2 мл) на ночь при температуре 4 °C.
14. На следующий день смойте гели пятью 30-минутными стирками, а затем три раза PBS. Оставьте последнюю промывку (2 мл) на ночь при температуре 4 °C.
15. На следующий день переложите капли в 96-луночный планшет с круглым (U)-дном с помощью шпателя с закругленными краями и ядра с противозакругленным краем путем инкубации с ядерным красителем Хёхста 10 мкг/мл (не менее 30 мкл/капля) в течение 30 минут в RT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы можно использовать монтажную среду с добавлением 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) для окрашивания ядер. В этом случае этот шаг и шаг 1.16 пропускаются, переходя непосредственно к шагу 1.17.
16. Переложите капли в 12-луночный планшет, содержащий 2 мл PBS/лунку, с помощью шпателя с закругленным краем и трижды промойте PBS.
17. Установите капли на предметное стекло микроскопа следующим образом:
    1. Нанесите тонкий слой быстротвердеющего монтажного материала на края квадратного покровного стекла размером 22 мм x 22 мм и дайте высохнуть ~1 минуте. Выполняйте этот шаг для каждой капли отдельно, чтобы избежать чрезмерного затвердевания монтажной среды.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните этот шаг в вытяжном шкафу, так как быстрозатвердевающая монтажная среда опасна для здоровья.
    2. Промойте каплю, опустив в лунку 12-луночный планшет, содержащий 2 мл деионизированной воды, и перенесите на предметное стекло микроскопа, используя шпатель с закругленными краями. Удалите лишнюю воду с помощью небольшого кусочка впитывающей бумаги.
    3. Нанесите на каплю 15 μл незатвердевающей монтажной среды, предотвращающей выцветание.
       ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, если ядерное окрашивание Hoechst не использовалось, можно использовать монтажную среду, содержащую 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI).
    4. Аккуратно расположите защитное стекло быстрозатвердевающим монтажным материалом к микроскопическому предметному стеклу над каплей и дайте ей осесть.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Быстротвердеющая среда прилипнет к микроскопическому предметному стеклу и удержит каплю на месте.
18. Повторите шаг 1.17 для всех капель. Закрепите по две капли на каждом предметном стекле микроскопа.
19. Дайте предметным стеклам высохнуть на воздухе при температуре RT в течение ~2 часов и храните при температуре 4 °C в течение ночи. Убедитесь, что горки расположены горизонтально и защищены от света.
20. Визуализируйте окрашенные нативные или конечные культуры FT ex vivo с помощью конфокального микроскопа или вертикального эпифлуоресцентного микроскопа, оснащенного функцией оптического среза и объективом 20x или 40x. Используйте функцию плитки, чтобы захватить большую площадь ткани за один раз.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Material			<
Greiner Bio-One	392-0019	Используется для иммунофлуоресценции
Круглые/плоские шпатели, нержавеющая сталь<	82027-528	Используется для иммунофлуоресценции всего крепления
Покровные стекла 22x22 мм стиль #1	Menzel/Fisher	15727582	Используется для монтажа
Microscope slides	Fisher	Kindler K102	Используется для монтажа
Впитывающая бумага	VWR	115-0202	Используется для монтажа
PBS tablets	Medicago	09-9400-100	Используется для подготовки 1x PBS
Acetone	Sigma-Aldrich	32201-2.5L-M	Используется для приготовления раствора после фиксации. ВРЕД: носите защитные перчатки и/или одежду. Используйте в вытяжном шкафу.
Methanol	Sigma-Aldrich	32213	Используется для приготовления раствора после фиксации. ТОКСИЧНОСТЬ: надевайте защитные перчатки и/или одежду. Используйте в вытяжном шкафу.
Triton X-100 (октилфенолэтоксилат)	Sigma-Aldrich	T9284	Используется для иммунофлуоресценции всего монтирования. ВРЕД: носите защитные перчатки и/или одежду.
Hoechst 33342, 20mM<	62249	Для противозакрашивания ядер. ВРЕД: надевайте защитные перчатки и/или одежду, а также средства защиты глаз и/или лица.
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	Наденьте защитные перчатки и/или одежду, а также защиту глаз. Используйте в вытяжном шкафу.
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200	Монтажная среда с противозакрашиванием ядер. Надевайте защитные перчатки и/или одежду, а также средства защиты глаз. Используйте в вытяжном шкафу.
Eukitt Быстрозатвердевающий монтажный medium	Sigma-Aldrich	03989-100ml	TOXIC: Носите защитные перчатки и/или одежду, а также защиту глаз. Используйте в вытяжном шкафу.
Рекомбинантный человек VEGFA	R&D Systems	293-VE-010	50 нг/ мл конечная концентрация
Рекомбинантный человеческий VEGFC	R&D Systems	752-VC-025	200 нг/ мл конечная концентрация
Рекомбинантный человеческий TGFβ	Millipore	GF346	1 нг/ мл конечная концентрация
Рекомбинантный человек bFGF	Millipore	01-106	50 нг/ мл конечная концентрация
CD31 (JC70A)	Dako	M0823	Используется при разведении 1:100, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD34 (QBEND10)	Dako	M716501-2	Используется при разведении 1:100, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD45 (2B11+PD7/26)	Dako	M070129-2	Используется при разведении 1:100, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD68	ImmunoWay	RLM3161	Используется при разведении 1:100, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
Craced caspase-3 (5A1E)	Cell Signalling	9664	Используется при разведении 1:200, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
ERG (EP111)	Dako	M731429-2	Используется при разведении 1:100, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
GFAP	Dako	Z0334	Использовано при разведении 1:100, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Ki67	Leica Microsystems	NCL-Ki67p	Использовано при разведении 1:1500, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Lyve1	R&D Systems	AF2089	Использовано при разведении 1:100, Donkey anti Goat Alexa 568 Secondary Ab
NG2	Millipore	AB5320	Использовано при разведении 1:100, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Prox1	ReliaTech	102-PA32	Использовано при разведении 1:200, Goat anti Rabbit Alexa 568 Secondary Ab
Prox1	R&D Systems	AF2727	Использовано при разведении 1:40, Chicken anti Goat Alexa 594 Secondary Ab
VEGFR3 (9D9F9)	Millipore	MAB3757	Использовано при разведении 1:100, Donkey Anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
α-SMA (1A4) style='width:174pt;'>Sigma	C6198	Использовано при разведении 1:400, Cy3 conjugated
Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgG	Life Technologies	A-21202	Использовано при разведении
Alexa Fluor594 Goat Anti-Rabbit IgG	Invitrogen	A-11012	Использовано при разбавлени<и
Thermo Scientific	A-11057	Использовано на 1:500 dilution
Alexa Fluor568 Goat anti-Rabbit IgG	Thermo Scientific	A-11036	Использовано при разведении
Alexa Fluor594 Курица против козы IgG	Молекулярные зонды	A-21468	Использовано на 1:500 dilution
Name	Company	Номер каталога	Comments
Microscopes
Инвертированный эпифлуоресцентный микроскоп Axiovert 200	Zeiss		Для визуализации свежего и встроенного в фибрин FT
AxioImager.Z1 вертикального эпифлуоресцентного микроскопа с Apotome	Zeiss		Для визуализации полностью окрашенного иммунофлуоресцентного микроскопа

td style='height:26.5pt;width:165pt;'>Пластины для клеточных культур, 96-well, U-bottom всего крепленияtd style='width:174pt;'>VWRtd style='width:174pt;'>Life Technologies 1:500 1:500 td style='height:15.75pt;width:165pt;'>Alexa Fluor568 Donkey Anti-Goat IgG 1:500