Иммуноокрашивание нейронов в срезах мозга мышей после флуоресцентной гибридизации in situ

Аннотация

Источник: Baleriola, J., et. al., обнаружение аксонально локализованных мРНК в срезах мозга с использованием гибридизации in situ с высоким разрешением. J. Vis. Exp. (2015)

Это видео демонстрирует обнаружение мРНК в холинергических аксонах в фиксированных срезах гиппокампа мыши с использованием флуоресцентной гибридизации in situ и окрашивания антителами. Флуоресцентная микроскопия выявляет пространственную локализацию меченых зондом мРНК и холинацетилтрансферазы в холинергических нейронах.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.

1. FISH с последующим иммуногистохимическим анализом с использованием индуцированного нагреванием антигена/РНК-демаскирования
   1. }
      1. Нагрейте гибридизационную печь до 40 °C и поместите противень с дистиллированной водой в духовку, чтобы создать увлажненную среду.
      2. Возьмите выдвижной ящик и положите внутрь бумажные полотенца, смоченные в дистиллированной воде, чтобы увлажнить его. Затем поместите ползунковую коробку в печь для гибридизации.
      3. Извлеките щупы (как отрицательные, так и целевые) из холодильника и нагрейте их в печи для гибридизации в течение 10 минут. Затем дайте зондам остыть на RT.
      4. Уравновешивайте реагенты амплификации AMP 1-4 (входят в набор флуоресцентных мультиплексных реактивов) в RT.
      5. Приготовьте раствор для извлечения антигена: 10 мМ цитрат натрия (pH 6), 0,05% Tween 20. Примечание: Раствор можно хранить в RT неограниченное время и использовать для будущего окрашивания.
      6. Приготовьте 1x промывочный буфер, разбавив 50x стоковый раствор (в наборе флуоресцентных мультиплексных реагентов) в воде, не содержащей РНКазы или обработанной DEPC.
         ПРИМЕЧАНИЕ: 1x буфер для стирки можно хранить в RT в течение 1 месяца и использовать для будущего окрашивания. 50-кратный буфер для стирки может выпасть в осадок. Если это так, нагрейте буфер для стирки 50x до 40 °C в течение 10 минут перед приготовлением раствора 1x.
   2. Удалите предметные стекла из 100% этанола и высушите на воздухе в течение 5 минут при температуре RT.
   3. Приготовьте банку с коплином, содержащую 50 мл раствора для извлечения антигена. Погрузите предметные стекла в раствор для извлечения антигена и прокипятите их 10 минут в микроволновой печи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы поместите предметные стекла горизонтально в круглую стеклянную чашку диаметром 100 мм, содержащую 100 мл раствора для извлечения.
      1. Наполните стакан объемом 1 л дистиллированной водой и поставьте его в микроволновую печь.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Вода будет "буферизовать" тепло при выполнении демаскирования.
      2. Поместите предметные стекла в раствор для извлечения антигена внутри микроволновой печи. Кипятить при высокой мощности в течение 5 минут. Сразу после того, как образцы перестанут кипеть, снова нагрейте слайды на высокой мощности в течение дополнительных 5 минут.
      3. Охладите слайды на RT.
         ПРИМЕЧАНИЕ: КРИТИЧЕСКИЙ ШАГ: продолжительность кипячения и процедура должны быть определены пользователем, в зависимости от характеристик микроволновой печи. Чем быстрее начнется закипание, тем выше шансы на испарение раствора. В этом случае рекомендуется варить образцы в течение более коротких периодов времени более двух раз, чтобы общее время демаскирования составило 10 минут. Напротив, если обогрев производится на средней или малой мощности, демаскировку можно проводить один раз в течение 10 минут. Однако, если образцы не кипятят непрерывно в течение примерно 10 минут, это может привести к частичной демаскировке как целевой РНК, так и белка, которые должны быть обнаружены.
   4. Вымойте слайды три раза с 1x PBS.
   5. Добавьте 2 - 3 капли (~100 μл) набора зондов dapB к тем срезам мозга, которые используются для оценки фонового окрашивания. ПРИМЕЧАНИЕ: Набор зондов dapB нацелен на бактериальный ген и не должен распознавать РНК млекопитающих.
   6. Добавьте 2 - 3 капли набора нацеленного зонда к тем срезам мозга, которые используются для обнаружения интересующей РНК. ПРИМЕЧАНИЕ: В этом примере используется набор зонда, нацеленный на остатки 20 - 1,381 мышиной Atf4 мРНК.
   7. Накройте предметные стекла парапленкой, чтобы избежать испарения зонда, поместите их в увлажненную ползунковую коробку внутри гибридизационной печи и инкубируйте при температуре 40 °C в течение 2 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: НЕОБЯЗАТЕЛЬНО: дополнительные срезы мозга могут быть гибридизированы с помощью набора зондов, нацеленных на мышь Polr2A и использованы в качестве положительного контроля.
   8. Дважды промойте предметные стекла с помощью 1x буфера для промывки в течение 2 минут при RT.
   9. Добавьте 2-3 капли реагента для амплификации AMP 1-FL на каждый срез мозга, накройте предметные стекла парапленкой, поместите их в слайд-бокс и инкубируйте при температуре 40 °C в течение 30 минут в печи для гибридизации.
   10. Дважды промойте предметные стекла 1x буфером для промывки в течение 2 минут при RT.
   11. Добавьте 2-3 капли амплификационного реагента AMP 2-FL на каждый срез мозга, накройте предметные стекла парапленкой, поместите их в слайд-бокс и инкубируйте при температуре 40 °C в течение 15 минут в гибридизационной печи.
   12. Дважды промойте предметные стекла 1x буфером для промывки в течение 2 минут при RT.
   13. Добавьте 2-3 капли реагента для амплификации AMP 3-FL на каждый срез мозга, накройте предметные стекла парапленкой, поместите их в слайд-бокс и выдерживайте при температуре 40 °C в течение 30 минут в печи для гибридизации.
   14. Дважды промойте предметные стекла с помощью 1x буфера для промывки в течение 2 минут при RT.
   15. Добавьте 2-3 капли реагента для амплификации AMP 4-FL на каждый срез мозга, накройте предметные стекла парапленкой, поместите их в коробку для слайдов и выдерживайте при температуре 40 °C в течение 15 минут в гибридизационной печи.
   16. Дважды промойте предметные стекла с 1x буфером для стирки в течение 2 минут при RT и дважды с 1x PBS.
   17. Добавьте 100 - 200 μл (или достаточный объем, чтобы полностью покрыть срезы) блокирующего раствора, содержащего 3 мг/мл BSA, 100 мМ глицина и 0,25% Triton X-100 в PBS (pH 7,4) на предметные стекла, накройте их парапленкой и инкубируйте в течение 30 минут при RT.
   18. } Добавьте 100 - 200 μл антитела против ChAT, разведенного в блокирующем растворе (1/100), на предметные стекла, накрыть их парапленкой, и выдерживать 2 дня при 4 °C. Следите за тем, чтобы срезы мозга не пересыхали. При необходимости повторно нанесите раствор антитела против ChAT на срезы мозга через 24 часа после инкубации.
   19. Промойте предметные стекла три раза в 1x PBS в течение 5 минут на RT.
   20. Добавьте 100 - 200 μл соответствующего Alexa-конъюгированного вторичного антитела (e.g., Alexa-594 donkey anti-goat для этого конкретного примера) на предметные стекла, накройте парапленкой и инкубируйте в течение 1 часа при RT.
   21. Промойте слайды три раза в 1x PBS в течение 5 минут при RT.
   22. Промойте предметные стекла один раз дистиллированной водой.
   23. Устанавливайте направляющие с помощью монтажного носителя, содержащего DAPI.
   24. Визуализируйте срезы мозга под флуоресцентным микроскопом.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Пользовательский зонд, нацеленный на остатки 20-1381 мРНК мыши Atf4 (NM_009716)	Advanced Cell Diagnostics	-	Probe
Пользовательский зонд, нацеленный на остатки 15-1256 мРНК ATF4 человека (NM_001675.2)	Advanced Cell Diagnostics	-	Probe
Negative control probe-DapB	Advanced Cell Diagnostics	310043	Probe
Positive control probe-mouse Polr2A (опционально)	Advanced Cell Diagnostics	312471	Probe
Goat polyclonal anti-ChAT антитела	Millipore	AB144P
Монтажный носитель ProLong Gold с DAPI	Life Technologies	P36935
RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit (для обнаружения флуоресценции)	Advanced Cell Diagnostics	320850	Набор для гибридизации in situ