Визуализация рецепторов нейротрансмиттеров в синапсах сетчатки с высоким разрешением

Аннотация

Источник: Zhang, J., et al. Количественный иммунозолотой анализ мембранных рецепторов в синапсах ленты сетчатки с высоким разрешением. J. Vis. Exp. (2016)

Это видео демонстрирует технику электронной микроскопии для визуализации локализации рецепторов нейротрансмиттеров в синапсах сетчатки. Срезы сетчатки содержат ганглиозные клетки сетчатки, которые проявляют мембраносвязанные нейротрансмиттеры рецепторы и помечены субъединицей холерного токсина B (CTB). После мечения маркеров антителами, конъюгированными с наночастицами золота, и контрокрашивания участка тяжелыми металлами рецепторы RGC визуализируют под микроскопом.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.

1. Фиксация ткани сетчатки

1. Соберите следующие материалы и инструменты: препарирующий микроскоп, 2 щипца с очень тонкими наконечниками, ножницы, целлюлозная фильтровальная бумага, пластиковая пипетка и предметное стекло для микроскопа.
2. Обезболить крысу в закрытой камере 2,0 мл галотана (ингаляционного анестетика). Определяют адекватную анестезию такими методами: отсутствие отвода задней лапы после защемления пальца ноги или отсутствие рефлекса моргания. Затем обезглавить сразу гильотиной. Удалите глаза ножницами для радужной оболочки глаза и поместите в стеклянную посуду, содержащую 4% параформальдегида в 0,1 М фосфатном буфере (PB) при pH 7,4.
3. С помощью препарирующего микроскопа удалите роговицу, срезав переднюю часть глазного яблока. Удалите хрусталик и стекловидное тело с внутренней поверхности сетчатки с помощью щипцов.
4. Отклейте склеру двумя щипцами до тех пор, пока сетчатка не будет изолирована от наглазника.
5. Разрежьте сетчатку сразу на полоски толщиной 100 - 200 мкм бритвой, и подвергнув фиксации pH-shift.
6. Зафиксируйте полоски сетчатки в 4% параформальдегиде в 0,1 М PB при pH 6,0 в течение 20 - 30 минут, а затем в 4% параформальдегиде плюс 0,01% глутаральдегид при pH 10,5 в течение 10 - 20 минут при комнатной температуре (RT).
7. После нескольких промываний в PB с 0,15 мМ CaCl₂ (pH 7,4 при 4°C) криозащитируйте полоски сетчатки глицерином (по 60 мин каждая в 10%, 20%, 30%, затем в течение ночи [O/N] через 30%) в 0,1 М PB перед замораживанием.

2. Замораживание

ПРИМЕЧАНИЕ:} Этот метод замораживания-замены модифицирован по сравнению с ранее опубликованным протоколом. Кроме того, важно, чтобы инструменты были очень холодными (надевайте перчатки); В противном случае ткань может частично оттаять при прикосновении к инструментам. Все эти шаги выполняются в камере автоматического замораживания и замещения (AFS), и инструменты никогда не должны перемещаться над краем камеры. Аналогичным образом, необходимо надлежащее охлаждение всех химических веществ, используемых в AFS.

1. Погрузите полоски сетчатки в жидкий пропан при температуре -184°C в приборе для криоконсервации (CPC) электронного микроскопа (ЭМ). Используя тонкую щетку, поместите образцы на небольшие кусочки двойной клейкой ленты, прикрепленные к металлическим огрызкам, которые идут на конце погружных стержней (отведите дополнительный буфер с помощью щетки).
2. Погрузите стержни в жидкий пропан и подержите их там около 5 секунд, а затем перенесите в автоматический инструмент для замораживания (AFS) с помощью небольшой транспортной камеры, заполненной жидким азотом (LN₂ охлажденный криоконтейнер).
3. После помещения замороженного образца и инструментов (щипцов и скальпеля) в AFS, охладите инструменты в камере в течение нескольких минут, прежде чем прикоснуться к ткани, или охладите их, поместив кончики инструментов на несколько секунд в маленькую транспортировочную камеру (заполненную жидким азотом (LN₂ охлажденный криоконтейнер для переноса)).
4. Оказавшись в AFS, Извлеките образец и скотч из огрызка с помощью тонкого скальпеля. Кроме того, во время этих процедур держите открытым регулятор потока газообразного азота, TF (TF описывается как «регулятор управления для испарителя LN₂)».
5. Перед тем, как поместить замороженную ткань в плоские держатели для заделки (т. е. , перед установкой AFS) вырежьте тонкий круг из прозрачного пластикового листа и поместите его на дно держателя, чтобы выровнять дно каждой лунки. Это позволяет относительно легко извлекать полимеризованные блоки образцов после их завершения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ранее мы использовали альтернативный метод плоских закладных держателей и использование двойных капсул Райхерта + желатина.
6. Используйте следующую автоматическую последовательность в AFS (используя терминологию прибора): T1 = -90°C в течение 32 часов, S1 = повышение температуры на 4°C/час (11,3 часа), T2 = -45°C в течение 50 часов, S2 = повышение температуры на 5°C/час (9 часов), T3 = 0°C в течение 40 часов (всего = 142,3 часа). Для помещения образцов в AFS (при -90°C) может потребоваться от 2 до 4 часов до начала синхронизированной последовательности.
7. Погрузите замороженные срезы в 1,5% уранилацетат в метаноле при температуре -90°C на >32 часа в AFS. Поместите по два кусочка салфеток (обычно) в каждую из семи лунок в плоский закладной алюминиевый держатель (три входят в AFS).
   1. Поместите салфетку + ленту в уранилацетат/метанол в лунки и снимите ленту позже, непосредственно перед началом инфильтрации среды для встраивания (например, Lowicryl HM20), если удалить ткань из ленты слишком сложно.
8. Затем ступенчато увеличивайте температуру до -45°C (+4°C в час; в автоматической последовательности).
9. Промойте образцы три раза в предварительно охлажденном метаноле, используя пластиковую пипетку с тонким наконечником, чтобы удалить старый раствор из каждого плоского закладного держателя, а затем с помощью другой стандартной пластиковой пипетки добавьте предварительно охлажденный свежий метанол.
10. Затем, используя тот же метод, постепенно инфильтруйте образцы низкотемпературными смолами, такими как средняя среда (HM20/метанол в соотношении 1:1 и 2:1, каждая в течение 2 часов, затем чистая смола в течение 2 часов, а затем меняйте смолы и сохраняйте O/N).
11. На следующий день снова смените смолу, регулируя уровень смолы так, чтобы она доходила только до верхнего края лунок.
12. Полимеризуйте образцы (от -45°C до 0°C в автоматической последовательности; +5°C в час) ультрафиолетовым (УФ) светом в течение 40 часов.
13. Затем извлеките образцы из AFS. Как правило, образцы блоков все еще демонстрируют некоторый розовый цвет. Поместите образцы рядом с флуоресцентным светом в вытяжной шкаф для химических веществ, с RT O/N или дольше, пока они не станут полностью прозрачными.

3. Поствстраивание EM Immunogold Immunocytochemistry

1. Разрежьте срезы 1 мкм ультрамикротомом, окрасьте срезы 1% толуидиновым синим и исследуйте их для ориентации срезов; Ориентируйте тканевый блок для достижения оптимальной поперечной плоскости разреза.
2. Вырежьте ультратонкие секции толщиной 70 нм с помощью ультрамикротома и соберите их на никелевые пазовые сетки с углеродным покрытием Formvar.
3. Промыть решетки один раз в дистиллированном H₂O, а затем трижды промыть трис-буферным физиологическим раствором (TBS, 0,05 M Tris buffer, 0,7% NaCl, pH 7,6).
4. Инкубировать в 20 мкл капель 5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) в TBS в течение 30 мин, а затем в 20 мкл капель, содержащих субъединицу козьего антихолерного токсина B (анти-CTB, 1:3000) и антитело к одной субъединице N-метил-D-аспартатного рецептора (NMDAR) (противокроличья глутаматергическая субъединица NMDAR A [GluN2A] 1:50, GluN2B 1:30) или антикроличий рецептор GluA2/3 (рецептор гетеротетраметической α-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовой кислоты [AMPA], 1:30) в TBS-Triton (TBST, 0,01% Triton X-100, pH 7,6) с 2% BSA и 0,02 M NaN₃} O/N на RT.}
5. Промойте сетки тремя отдельными каплями (20 μл) TBS (pH 7,6) в течение 10, 10 и 20 минут, а затем TBS (pH 8,2) в течение 5 минут.
6. {{}}Инкубируйте сетки в течение 2 часов капли (20 μл) смеси, содержащей ослиный антикроличий иммуноглобулин G (IgG, 1:20), соединенный с частицами золота 10 нм и IgG против коз осла (1:20), соединенный с частицами золота с длиной волны 18 нм в TBST (pH 8,2) с 2% BSA и 0,02 M NaN₃.
7. Вымойте решетки в каплях TBS (pH 7,6) по 20 μл в течение 5, 5 и 10 минут, затем в ультрачистой воде, а затем высушите их.
8. Противопятните сетки 5% уранилацетата и 0,3% цитрата свинца в дистиллированном H₂O в течение 8 и 5 мин в темноте соответственно.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Paraformaldehyde	EMS	15710
Glutarldehyde	EMS	16019
NaH2PO4	Sigma	S9638
Na2HPO4	Sigma	7782-85-6
CaCl2	Sigma	C-8106
BSA	Sigma	A-7030
Triton X-100	Sigma	T-8787
NaOH	Sigma	221465
NaN3	JT Baker	V015-05
Glycerol	Gibco BRL	15514-011
Lowicryl HM 20	Polysciences	15924-1
Tris-Base	Fisher	BP151-500
Tris	Fisher	04997-100
Anti-GluN2A	Millipore	AB1555P	Dilution 1/50
Anti-GluN2B	Millipore	AB1557P	Dilution 1/30
Anti-GluA2/3	Millipore	AB1506	Dilution 1/30
Anti-PSD-95	Millipore	MA1–046	Dilution 1/100
Donkey anti-rabbit IgG-10 nm золотые частицы	EMS	25704	Dilution 1/20
Donkey anti-mouse IgG-10 nm золотые частицы	EMS	25814	Dilution 1/20
Donkey anti-mouse IgG-5 nm золотые частицы	EMS	25812	Dilution 1/20
Donkey anti-goat IgG-18 nm золотые частицы	Jackson ImmunoResearch	705-215-147	Dilution 1/20
Formvar-Carbon покрытые никелевыми щелями.	EMS	FCF2010-Ni
Uranyl acetate	EMS	22400-1
Methanol	EMS	67-56-1
Цитрат свинца	Leica
Leica EM AFS	Leica
Leica EM CPC	Leica
Ultromicrotome	Leica
JEOL 1200 EM	JEOL
жидкий азот	Roberts Oxygen
Propane	Roberts Oxygen
CTB	List Biological Laboratories	104	1-1.2%
Anti-CTB	List Biological Laboratories	703	Dilution 1/4000